ブログ

Mar 08, 2023

機械感応アダプター Hic のノックダウン

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 7446 (2023) この記事を引用

377 アクセス

メトリクスの詳細

変形性関節症 (OA) は、関節軟骨の破壊に関連する最も一般的な関節疾患です。 マトリックスメタロプロテイナーゼ 13 (MMP-13) は、関節軟骨の主要成分であるコラーゲン II の分解による OA の発症において重要な役割を果たしています。 過酸化水素誘導性クローン 5 (Hic-5; TGFB1I1) は、トランスフォーミング成長因子 β 誘導性メカノセンサーであり、マウス変形性関節症病変における MMP-13 発現を上方制御することによって OA の発症を促進することが以前に報告されています。 我々の現在の研究では、免疫組織化学的分析により、ヒトOA軟骨では正常な軟骨と比較してHic-5タンパク質の発現が増加していることが示されました。 機能実験により、ヒト軟骨細胞において、Hic-5 および MMP-13 の発現が機械的ストレスによって増加し、機械的ストレスによって誘導される MMP-13 発現が Hic-5 siRNA によって抑制されることが実証されました。 さらに、機械的ストレスを受けたヒト軟骨細胞では、Hic-5の細胞内局在が接着斑から核に移行し、核のHic-5がMMP-13遺伝子発現を増加させた。 インビボでの Hic-5 siRNA の関節内注射は、変形性関節症研究協会国際スコアと OA ラットの関節軟骨における MMP-13 タンパク質発現を減少させました。 我々の発見は、Hic-5がヒト軟骨細胞におけるMMP-13の転写を調節していること、そしてラットにおけるHic-5 siRNAの関節内注射によりOAの進行が抑制されたことから、Hic-5がOAの新たな治療標的となる可能性があることを示唆している。

変形性関節症 (OA) は、関節軟骨の劣化を特徴とする最も一般的な関節疾患です。 多数の研究により、肥満、遺伝的素因、老化、外傷、炎症、過度の機械的ストレスなど、複数の危険因子が OA 発症に寄与していることが明らかにされています 1、2、3、4。 細胞ストレッチャーシステムを使用したこれまでの in vitro 実験では、過度の機械的ストレスが、関節軟骨の主要成分であるコラーゲン II の分解による OA の発症に重要な役割を果たすマトリックスメタロプロテイナーゼ 13 (MMP-13) の発現を誘導することが示されています 5,6。 7。 マウスにおける MMP-13 ノックアウトは、野生型 (WT) マウスと比較して、外科的誘導によって引き起こされる軟骨分解を防ぎます 8。 逆に、構成的に活性なMMP-13が軟骨に特異的に発現したトランスジェニックマウスは、ヒトOA9と同様の関節軟骨びらんを示す。

過酸化水素誘導性クローン 5 (Hic-5) は、過酸化水素とトランスフォーミング成長因子 β (TGF-β)10 によって誘導される遺伝子として単離された足場タンパク質です。 我々は以前に、Hic-5の細胞内局在が機械的ストレスに応答して接着斑からストレスアクチン線維に移行し、Hic-5が細胞の収縮能力を制御することを実証しました11。 さらに、Hic-5 はさまざまな疾患の発症に関与していることが報告されています。 我々の以前の研究では、Hic-5 が膜型 1 型 MMP の発現を調節することにより活性型 MMP-2 を増加させ、腹部大動脈瘤の形成や破裂を引き起こすことが示されました 12。 乳房腫瘍では、Hic-5 は細胞外マトリックス (ECM) の沈着と細胞の収縮に必要であり、Hic-5 欠損マウスでは肺への転移が減少します 13。 これらの疾患における Hic-5 の関与の詳細なメカニズムには違いがありますが、ECM リモデリングは共通のメカニズムです。

最近、我々は、初期の OA 発症中にマウスの関節軟骨で Hic-5 の発現が増加し、Hic-5 を欠損するマウスは WT マウスよりも軟骨びらんが大幅に少ないことを発見しました 14。 マウス軟骨細胞を用いたインビトロ実験でも、Hic-5欠損により、過剰な機械的ストレスによって誘導されるMMP-13発現が減少することが実証された。 この研究は、ヒト軟骨細胞における過剰な機械的ストレスによって誘導されるMMP-13発現にHic-5が関与しているかどうかを判定し、in vivoでのOAの治療標的としてのHic-5の有効性を調査することを目的とした。

ヒト OA の発症における Hic-5 の役割を調査するために、我々はまずヒト OA 軟骨における Hic-5 の発現を調べました。 免疫組織化学により、OA 軟骨では正常軟骨よりも Hic-5 発現が高く (図 1A、B)、OA 軟骨では Hic-5 陽性細胞の数が有意に増加していることが示されました (図 1C)。 これらの結果は、外科的に誘導されたOA14を有するマウスの軟骨においてHic-5が高度に発現されることを示す我々の以前の報告と一致した。

ヒト変形性関節症 (OA) 軟骨における過酸化水素誘導性クローン 5 (Hic-5) 発現の誘導。 (A、B) 正常および OA 軟骨における Hic-5 の代表的な免疫組織化学的染色。 破線は関節軟骨表面を示します。 (A) の元の倍率 × 100。 ×400インチ(B)。 バー = 100 μm。 (C) 正常 (n = 3) および OA 軟骨 (n = 3) における Hic-5 陽性細胞の定量化。 データは対応のない t 検定によって分析されました。 値は平均値±SEMです。 **P < 0.01。

以前の研究では、マウス関節軟骨細胞における Hic-5 および MMP-13 の発現が過度の機械的ストレスによって増加することを実証しました 14。 したがって、ヒト関節軟骨細胞でも、他の MMP およびマトリックスメタロプロテイナーゼ 1 の組織阻害剤 (TIMP-1) に加えて、機械的ストレスによって誘導される Hic-5 および MMP-13 の発現が増加するかどうかを調査しました。 その結果、刺激を受けていない軟骨細胞と比較して、機械的ストレスによって刺激されたヒト軟骨細胞では、Hic-5、MMP-3、およびMMP-13 mRNAレベルが増加しました（図2A）。 MMP-1 発現は機械的ストレスによって上方制御される傾向がありましたが、その差は有意ではなく、MMP-2 または TIMP-1 発現に対する機械的ストレスの影響はありませんでした。 次に、Hic-5 低分子干渉 RNA (siRNA) とネガティブコントロールとしてコントロール siRNA を使用して、MMP 遺伝子発現に対する Hic-5 ノックダウンの影響を調べました。 siRNA による Hic-5 ノックダウンは、機械的ストレスがなければ MMP-13 発現を変化させませんでしたが、機械的ストレス誘発性の MMP-13 発現は、対照 siRNA と比較して Hic-5 siRNA によって有意に減少しました。 しかし、Hic-5 siRNAはMMP-1またはMMP-3の発現に影響を与えませんでした（図2B）。 これらの結果は、Hic-5ノックアウトマウスから単離された軟骨細胞で観察された以前の結果と同様であり、Hic-5が機械的ストレス下で他のMMPの中でMMP-13遺伝子発現を特異的に調節することを示した。

ヒト軟骨細胞における Hic-5 ノックダウンによる機械的ストレス誘発性マトリックスメタロプロテイナーゼ (MMP-13) 発現の減衰。 (A) 30 分間機械的ストレスに曝露された (MS+) または未処理 (MS-) のヒト軟骨細胞における Hic-5、MMP、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ-1 の組織阻害剤 (TIMP-1) の mRNA レベル。 機械的ストレスの 1 時間後に細胞を収集しました。 (n = 8 生物学的複製)。 (B) 機械的ストレスの有無にかかわらず、ヒト軟骨細胞における Hic-5 ノックダウンに応答した遺伝子発現の変化。 ヒト軟骨細胞を、機械的ストレスによる刺激の前に、Hic-5 siRNA (10 nM) またはコントロール siRNA (10 nM) で 24 時間処理しました。 (n = 4 生物学的複製)。 mRNA の相対レベルは、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって決定されました。 値は平均値±SEMです。 *P < 0.05; **P < 0.01; §P = 0.0572 (A) の対応のない t 検定、または (B) の多重比較に対する Tukey の検定による一元配置分散分析。

次に、機械的ストレスの有無にかかわらず、ヒト軟骨細胞におけるHic-5の細胞内局在を観察しました。 Hic-5 は、非刺激条件下では接着斑で検出されましたが、接着斑における Hic-5 の発現は、0.5 Hz、10% の周期的引張ひずみを 30 分間負荷した後に減衰しました (図 3A)。 さらに、3 時間の周期的引張ひずみ負荷後の核では、Hic-5 染色が顕著でした (図 3A)。 Hic-5 は通常、核輸出シグナル (NES) を介して接着斑と核の間を行き来します 15。 機械的ストレスがシャトル速度を加速する可能性を考慮して、NES阻害剤であるレプトマイシンB（LMB）で処理した場合の周期的引張ひずみ後のHic-5の細胞内局在の変化を調べた。 核内のシグナル強度は、処理後1時間でLMBによってわずかに増加しましたが、1時間の機械的ストレスとLMBの両方の追加は、ヒト軟骨細胞におけるHic-5の核局在化を明らかに誘導しました（図3B）。 私たちの以前の研究では、H2O2 に応答して核に蓄積された Hic-5 が c-fos15 の転写制御に関与していることが報告されました。 総合すると、これらのデータは、機械的な力によって引き起こされる接着斑から核への Hic-5 の転座が MMP-13 発現を調節することを意味します。

機械的ストレスによって刺激されたヒト軟骨細胞における Hic-5 の細胞内局在。 (A) 30 分間または 3 時間機械的ストレスにさらされたヒト軟骨細胞 (MS+)、または未処理 (MS-) における Hic-5 の細胞内局在。 矢印の頭は接着斑を示します。 (B) 機械的ストレス後のヒト軟骨細胞における核 Hic-5 の免疫蛍光イメージング。 ヒト軟骨細胞を 10 ng/ml レプトマイシン B (LMB) と機械的ストレスに 1 時間曝露しました。 核を DAPI (青) で対比染色しました。 代表的な画像は 3 つの生物学的複製から選択されました。 元の倍率: × 400。バー = 50 μm。

MMP-13 発現がヒト軟骨細胞の核局在化 Hic-5 によって誘導されるかどうかを調べるために、核局在化シグナル (NLS) 結合 Hic-5 発現ベクター (NLS-HA-hic) を使用して Hic-5 を核内に強制発現させました。 -5)。 NLS-HA-Hic-5は、ヒト軟骨細胞におけるMMP-13のmRNAレベルを用量依存的に増加させた(図4A)。 同様に、Hic-5 と MMP-13 のウェスタンブロット分析と二重免疫蛍光染色により、トランスフェクトされていない軟骨細胞と比較して、NLS-HA-hic-5 発現軟骨細胞で MMP-13 タンパク質が増加していることが示されました（図 4B、C）。

ヒト軟骨細胞における核 Hic-5 による MMP-13 発現の上方制御。 (A) 核局在化シグナルでタグ付けされた Hic-5 (NLS-HA-Hic-5) を外因的に発現するヒト軟骨細胞における MMP-13 の誘導。 ヒト軟骨細胞に、グラフに示されている濃度の NLS-HA-Hic-5 発現ベクターを 24 時間トランスフェクトしました。 Hic-5 および MMP-13 の発現は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって測定されました (n = 3 生物学的複製)。 (B) 0.2 μg の NLS-Hic-5 の有無にかかわらずトランスフェクトされたヒト軟骨細胞における MMP-13 のウェスタンブロット (n = 3 生物学的複製)。 値は平均値±SEMです。 **クラスカル・ウォリス検定、その後のダンの多重比較検定 (A) または対応のない t 検定 (B) による P < 0.01。 ウェスタンブロット画像は切り取られ、全長ブロットは補足図1に含まれています。(C) NLS-HA-の有無にかかわらずトランスフェクトされたヒト軟骨細胞におけるHic-5（緑色）およびMMP-13（赤色）の二重免疫蛍光染色。 Hic-5。 核を DAPI (青) で対比染色しました。 代表的な画像は 3 つの生物学的複製から選択されました。 元の倍率: × 400。バー = 50 μm。

我々は、OA のラット外科モデルを使用して、OA 発症における Hic-5 の治療可能性を評価しました。 まず、ラット Hic-5 siRNA を設計し、JTC-19 および RAT-2 ラット細胞株の両方でその効果を検証しました。 Hic-5 siRNA発現細胞では、コントロールと比較してHic-5の発現が顕著に抑制されていた（図５A）。 次に、内側半月板切除術（MMx）後 10 日目から 19 日目まで、3 日ごとに Hic-5 siRNA をラット膝関節の関節内腔に注射しました（図 5B）。

ラット内側半月板切除術 (MMx) モデルにおける OA に対する Hic-5 ノックダウンの in vivo 効果。 (A) Hic-5 siRNA をトランスフェクトしたラット細胞株における Hic-5 の mRNA レベル (n = 5 生物学的複製)。 値は平均値±SEMです。 **P < 0.01、多重比較のための Tukey 検定による一元配置分散分析による。 (B) siRNA の関節内注射による OA 誘導と治療の外科的手順のタイムライン。 手術後 10 日目に、OA 誘発を確認するためにラットを屠殺しました (10 日目) (n = 3)。 Hic-5 siRNA (n = 8) またはビヒクルとしてのヌクレアーゼフリー水 (n = 8) を、手術後 10、13、および 16 日目に膝関節の関節内腔に投与し (合計 3 回の注射)、未治療の状態で投与しました。ラットを対照とした(n = 3)。 (C) MMx を受けたラットの脛骨軟骨の代表的なサフラニン O 染色。 右パネルは、左パネルのボックス領域の高倍率図を示しています。 左パネルの元の倍率 × 40、バー = 500 μm。 右パネルでは × 100、バー = 200 μm。 (D) 示されたグループにおける軟骨分解の OA Research Society International (OARSI) スコア。 線は中央値を表します。 *P < 0.05、クラスカル・ウォリス検定とそれに続くダンの多重比較検定による。

組織学的分析により、OA 病変の形成が術後 10 日目にすでに起こっていることが示されました。 siRNA注射の開始から9日後である19日目に、siRNAを注射したラットグループはOAの進行が抑制され、溶媒グループよりも低い国際変形性関節症研究協会（OARSI）スコアを示しました（図5C、Dおよび補足表2）。 。 さらに、免疫組織化学により、siRNAを注射しなかった群（10日目、未治療群、およびビヒクル群を含む）と比較して、siRNA注射群の膝軟骨におけるHic-5およびMMP-13発現の減少が確認されました（図6A〜D）。 総合すると、これらの結果は、過度の機械的ストレスによって誘導されたHic-5がMMP-13転写を増加させることによってOAの発生を促進することを示した(図6E)。

Hic-5 siRNA のラットへの関節内注射による、MMx によって誘導される Hic-5 および MMP-13 のタンパク質発現の in vivo 抑制。 (A、B) Hic-5 siRNA (n = 8) またはビヒクル (n = 8)、または治療なしの MMx 手術脛骨軟骨 (10 日目、n = 3 および MMx 後 19 日未治療、n = 3)。 ファロイジン (赤) を使用して総細胞数を数えました。 元の倍率 × 200、バー = 100 μm。 (C、D) ラットの脛骨軟骨における Hic-5 陽性細胞 (C) および MMP-13 陽性細胞 (D) の割合。 値は平均値±SEMです。 *P < 0.05; **P < 0.01、Tukey の多重比較検定による一元配置分散分析による。 (E) 過剰な機械的ストレスが Hic-5 を介して MMP-13 発現を誘導し、その結果 OA が発症することを示す概略モデル。

現在の研究は、Hic-5が軟骨分解を促進することによりOA発症の主要な調節因子であることを特徴づけている。 ヒト OA 軟骨では Hic-5 発現が大幅に増加しましたが、非 OA 軟骨では増加しませんでした。 in vitro 実験では、過剰な機械的ストレスがヒト軟骨細胞で Hic-5 および MMP-13 の発現を誘導し、Hic-5 のノックダウンにより OA 形成における主要な ECM 分解酵素である MMP-13 の発現上昇が抑制されることが示されました。 さらに、過剰な機械的ストレスにより、接着斑から核への Hic-5 の細胞内局在が変化し、Hic-5 の核蓄積により MMP-13 の転写制御が引き起こされました。 in vivo 実験では、OA モデルラットにおいて、Hic-5 siRNA の関節内投与が MMP-13 発現を下方制御し、軟骨分解に対する保護効果があることが示されました。 総合すると、これらの結果は、Hic-5 が OA の有望な治療標的である可能性があることを示しました。

Hic-5 は、複数の細胞シグナルの足場および ECM 関連遺伝子発現の調節因子としての機能を通じて、肝線維症、膵臓線維症、結腸直腸がんなどのさまざまな疾患の発症に関与しています。 我々は以前、これらの疾患を持つ患者ではHic-5の発現が健康な対照よりも高いことを報告した。 肝臓および膵臓の線維症では、Hic-5 が TGF-β/Smad2 経路の足場として機能し、その欠損により、線維症の主要な ECM 成分であるコラーゲン産生が減少するため、マウスの肝臓および膵臓の線維症が大幅に軽減されます 16,17。 さらに、ヒト正常線維芽細胞においてアデノウイルスベクターを使用して Hic-5 を過剰発現させると、ECM の剛性を高め、腫瘍の進行を促進するリシルオキシダーゼ (LOX) の発現が増加することを実証しました 18。 さらに興味深いことに、アゾキシメタン誘発性結腸直腸腫瘍の発生率は、WT マウスと比較して Hic-5 欠損マウスで抑制されました。 この研究では、同様に、Hic-5 が MMP-13 の調節因子として ECM に富む軟骨の溶解を制御すること、および siRNA による Hic-5 のノックダウンがラットの外科的に誘発された OA の減弱をもたらすことを発見しました。 さらに、ヒト OA 軟骨では Hic-5 発現が上昇しました。 総合すると、Hic-5 はヒトの OA の過程において ECM 調節因子としての役割を果たしている可能性があります。

この研究により、機械的ストレスがヒト軟骨細胞における Hic-5 遺伝子の発現と転座を誘導するという新しい発見が明らかになりました。 Hic-5 は主に接着斑に存在し、正常ヒト線維芽細胞では ROS による刺激下、機械的ストレスのない正常ヒト皮膚線維芽細胞では TGF-β による刺激下で核内に見られます 15,19。 しかし、我々は以前に、マウス胎児線維芽細胞における機械的ストレス後に、Hic-5が接着斑からアクチン線維に移動することを示した11。 これらの結果と現在のデータは、Hic-5 転座の点で異なります。これは、分析で使用された異なる機械的ストレス条件と異なる細胞タイプによるものと考えられます。

結腸直腸がんでは、核に蓄積した Hic-5 が LOX の発現を誘導し、コラーゲン線維の架橋を触媒して ECM の剛性を高めます 18。 さらに、Hic-5 は機械的ストレス後に核に移行し、軟骨細胞におけるマトリックス分解酵素の遺伝子発現に関与します。 ECM の剛性の増加による癒着斑への刺激は、機械的応力負荷条件と一致します。 まとめると、Hic-5 は、ECM の剛性の増加を感知することで ECM 微小環境の剛性の調節に相互的な役割を果たしている可能性があり、これにより核移行と ECM の剛性制御に関連する遺伝子発現の誘導が引き起こされます。 Hic-5 遺伝子発現は機械的ストレスによりわずかに増加しましたが、MMP-13 発現はヒト軟骨細胞において有意に抑制されました。 これらの結果は、機械的ストレスによって誘発される Hic-5 発現の増加ではなく、Hic-5 の核移行が OA 発症にとって重要であることを示唆しています。

我々は以前、Hic-5 が AP-1、Ets、および Sp1 結合部位を介して c-fos 遺伝子発現を調節することを報告しました 20。 さらに、MMP ファミリーの大部分はプロモーター領域に AP-1 結合部位を有し、選択的 c-Fos/AP-1 阻害剤がヒト軟骨細胞における MMP-13 発現を抑制することはよく知られています。 さらに、阻害剤の関節内投与は、マウス OA モデルにおける MMP-13 発現を抑制します 21。 したがって、Hic-5 は AP-1 と相互作用することによって MMP-13 の転写を促進する可能性があります。

最近、新しい治療薬の可能性を探るため、小分子薬剤の関節内注射によって治療される動物OAモデルのさまざまな研究が行われています。 例えば、デキサメタゾン、レバミピド、またはスタチンの関節内注射は、MMP-13 発現の下方制御を通じて動物モデルにおける OA の進行を防ぎます 22、23、24、25、26、27。 Hic-5は細胞内アダプタータンパク質であり酵素活性を持たないため、従来、低分子薬剤による阻害が難しいと考えられていました。 しかし、in vivo での Hic-5 の阻害は、細胞膜を越えて選択的に遺伝子をノックダウンできる新しいツールである核酸治療薬によって最近可能になりました。 本研究では、Hic-5 siRNA の関節内注射により、ラットの OA の進行が抑制されました。 したがって、我々は、Hic-5 が OA の治療標的であることを同定しただけでなく、Hic-5 siRNA が OA の新規治療薬となる可能性があることを証明しました。

要約すると、我々は、Hic-5がMMP-13の転写メディエーターとして軟骨分解を調節することを実証した。 我々の発見は、Hic-5 siRNAには潜在的な治療応用があり、OAにおいて臨床的に有用である可能性があることを示唆しています。

ホルマリン固定され、パラフィン包埋されたヒト関節軟骨組織切片は、ORIGENE (メリーランド州、米国) から購入しました。 正常な関節軟骨は 36 歳、52 歳、57 歳の男性 3 名から採取しました。3 つの OA 軟骨は 73 歳と 76 歳の男性 2 名、および 87 歳の女性 1 名から採取しました。ラット脛骨軟骨は 10% 緩衝ホルマリンで固定し、ギ酸で脱灰し、包埋しました。パラフィン中で調製し、厚さ 4 μm の切片に切断します。

免疫組織化学では、CSAII ビオチンフリーチラミドシグナル増幅システム (Aglient technology、カリフォルニア州、米国) によってシグナルを検出しました。 切片を抗 H​​ic-5 一次抗体 (1:100; 611165、BD Biosciences、ニュージャージー州、米国) および抗 MMP-13 抗体 (1:150; ab39012、Abcam、ケンブリッジ、英国) とインキュベートし、 DAPI またはファロイジン。 Hic-5 および MMP-13 陽性細胞の数は、膝関節の矢状切片の免疫陽性細胞を 200 倍の倍率で計数することによって定量されました。 陽性細胞の割合は、BZ-II Analyzer ソフトウェア (Keyence、大阪、日本) を使用して決定されました。

免疫細胞化学では、培養軟骨細胞を 3.7% 緩衝ホルマリンで固定し、3% ウシ血清アルブミン (Sigma Aldrich、タウフキルヒェン、ドイツ)/0.1% Tween-20 を含むリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) でブロックしました。 細胞を一次抗体で室温で 1 時間染色し、Alexa Fluor 結合二次抗体 (Invitrogen、MA、USA) とともにインキュベートしました。

26歳の男性と47歳の男性から得た正常なヒト関節軟骨細胞をLonzaから購入し、製造業者の指示に従って軟骨細胞基本培地（Lonza、スイス、バーゼル）で培養した。 継代 3 ～ 6 のヒト軟骨細胞を実験に使用しました。

ヒト軟骨細胞を、フィブロネクチン (354008; Corning, NY, USA) でコーティングされたシリコンチャンバー上に 4 × 104 細胞/チャンバーで播種しました。 各チャンバーの培養面は 2 × 2 cm でした。 CO2 インキュベーター内で NS-550 一軸延伸システム (STREX、大阪、日本) を使用して、周期的引張ひずみ (0.5 Hz、10% 伸び) を加えました。

シリコンチャンバー上で培養したヒト軟骨細胞を、Hic-5 siRNA (順方向: 5'-GGACCAGUCUGAAGAUAAG-3'、逆方向: 5'-CUUAUCUUCAGACUGGUCC-3'、10 nmol/L) またはコントロール siRNA (10 nmol/L、Ambion、テキサス州) で 4 時間トランスフェクトしました。 、米国）リポフェクタミン RNA iMAX（Invitrogen、マサチューセッツ州、米国）を使用。 次に、細胞を PBS で洗浄し、37 °C で 20 時間培養しました。 その後、セルに周期的な引張ひずみを加えた。 hic-5 の N 末端に核局在シグナル (NLS) を運ぶ融合タンパク質を発現させるために、以前に記載されている 20 NLS hic-5 発現ベクター (NLS-HA-hic-5) をリポフェクタミンを使用してトランスフェクトしました。 3000 (米国マサチューセッツ州インビトロジェン)。

全 RNA 抽出と逆転写は、メーカーの指示に従って qPCR 用 SuperPrep II Cell Lysis RT Kit (TOYOBO、大阪、日本) を使用して実行されました。 Hic-5、MMP-13、MMP-1、MMP-2、MMP-3、および TIMP-1 の mRNA 発現を定量するために、KOD SYBR q PCR Mix (TOYOBO、大阪、日本) を使用してリアルタイム qPCR 分析を実行しました。 。 プライマー配列を補足表 1 に示します。標的遺伝子発現は、2-ΔΔCt 法を使用して GAPDH に対して正規化しました。

タンパク質は、2% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) を含む溶解溶液を使用してヒト軟骨細胞から抽出されました。 タンパク質を SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画し、ポリ二フッ化ビニリデン膜に転写し、抗 MMP-13 (1:1000; Abcam、ケンブリッジ、英国)、抗 HA (1:1000、Proteintech、イリノイ州、米国) を使用して検出しました。 ）、および抗 GAPDH（1:5000; MBL、東京、日本）抗体。 バンド密度はデンシトグラフ ソフトウェア (ATTO、東京、日本) で定量化されました。

動物実験は株式会社ユニテック動物管理使用委員会の承認を受け、倫理ガイドラインに従ってユニテックにて実施されました。 すべての方法は ARRIVE ガイドライン (https://arriveguidelines.org) に従って報告されました。 生後 7 週齢の Slc:Wistar 雄ラットを、手術が行われるまで 1 週間、温度制御された部屋で 12 時間の光サイクル下で飼育しました。 実験的な OA は MMx28 によって誘発されました。 簡単に説明すると、ラットに麻酔を導入しました [メデトミジン (2 mg/kg 体重)、ミダゾラム (0.4 mg/kg)、ブトルファノール (5 mg/kg)]。 膝とその周囲を剃りました。 右膝の前面を縦方向に切開した。 次に、右膝の内側側副靱帯と前十字靱帯を切断しました。 次に、内側半月板を除去しました。 膝関節包と皮下組織を縫合し、皮膚を閉じた。 関節内治療は手術の10日後に開始されました。 AteloGene Local のビヒクルとして Hic-5 siRNA (順方向: 5ʹ-GGAUCAUCUAUACAGCACA-3ʹ; 逆方向: 5'-UGUGCUGUAUAGAUGAUCC-3'、10 nmol/L) (n = 8) またはヌクレアーゼフリー水 (n = 8) のいずれか使用 Ｑｕｉｃｋ ｇｅｌａｔｉｏｎ（Ｋｏｋｅｎ、東京、日本）を製造業者のプロトコールに従ってラット膝関節の関節内腔に注入した。 OA 重症度は、UNITECH Co. Ltd の OARSI スコアリング システムを使用して定量化されました29,30。

データの正規性は、Shapiro-Wilk 正規性検定によって評価されました。 分布が正規の場合、対応のない t 検定を使用してサンプルの 2 つのグループを比較し、テューキーの多重比較検定による一元配置分散分析を使用して 3 つ以上のグループからのデータを比較しました。 クラスカル・ウォリス検定とそれに続くダン検定を使用して、複数のグループからのノンパラメトリック データを比較しました。 すべての分析は、GraphPad Prism ソフトウェアを使用して実行されました。 結果は平均値±SEMとして報告されます。 0.05 未満の P 値は有意であるとみなされました。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータがこの記事に含まれています。 さらに詳しい問い合わせは責任著者に問い合わせてください。

Wilder, FV、Hall, BJ、Barrett, JP、Lemrow, NB 急性膝損傷および変形性膝関節症の歴史: 前向き疫学的評価 クリアウォーター変形性関節症研究。 変形性関節症。 カルティル。 10、611–616 (2002)。

記事 CAS Google Scholar

Coggon, D. et al. 変形性膝関節症と肥満。 内部。 J.オベス。 関連。 メタブ。 障害。 25、622–627 (2001)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Palazzo, C.、Nguyen, C.、Lefevre-Colau, MM、Rannou, F. & Poiraudeau, S. 変形性関節症の危険因子と負担。 アン。 物理学。 リハビリ。 医学。 59、134–138 (2016)。

論文 PubMed Google Scholar

Buckwalter, JA、Saltzman, C. & Brown, T. 変形性関節症の影響: 研究への影響。 クリン。 整形外科。 関連。 解像度 427、S6–S15 (2004)。

記事 Google Scholar

哲永 哲 ほか SW1353軟骨細胞様細胞におけるRUNX-2転写因子による機械的ストレス誘発性MMP-13およびADAMTS-5発現の制御。 変形性関節症。 カルティル。 19、222–232 (2011)。

記事 CAS Google Scholar

Liu、Q.ら。 軟骨細胞の表現型および軟骨細胞の細胞外マトリックスの発現に対する機械的ストレスの影響。 科学。 議員 6、37268。https://doi.org/10.1038/srep37268 (2016)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhu, G.、Qian, Y.、Wu, W. & Li, R. インビトロでの軟骨細胞損傷に対する高い機械的引張ひずみ刺激の負の効果。 生化学。 生物物理学。 解像度共通。 510、48–52 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

リトル、CBら。 マトリックスメタロプロテイナーゼ 13 欠損マウスは、変形性関節症による軟骨びらんには耐性がありますが、軟骨細胞の肥大や骨棘の発生には耐性がありません。 リウマチ性関節炎。 60、3723–3733 (2009)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Neuhold, LA et al. 恒常的に活性なヒトコラゲナーゼ-3 (MMP-13) の硝子軟骨における出生後の発現は、マウスの変形性関節症を誘発します。 Ｊ．クリン． 調査します。 107、35–44 (2001)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shibauma, M.、Mashimo, J.、Kuroki, T. & Nose, K. 推定上の新規ジンクフィンガータンパク質をコードする TGF β 1 誘導性 hic-5 遺伝子の特性評価と、細胞老化へのその関与の可能性。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 269、26767–26774 (1994)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

キム・カネヤマ、JR 他一軸伸長は、生体内で平滑筋細胞に発現する Hic-5 の細胞内局在を調節します。 Ｊ．Ｃｅｌｌ． 科学。 118、937–949 (2005)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

レイ、XF 他。 腹部大動脈瘤の発症における MKK4/p54 JNK 経路の新規足場としての Hic-5 の同定。 混雑する。 心臓。 准教授 3、e000747。 https://doi.org/10.1161/JAHA.113.000747 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Goreczny, GJ、Ouderkirk-Pecone, JL、Olson, EC、Krendel, M. & Turner, CE 間質マトリックスの Hic-5 リモデリングは乳房腫瘍の進行を促進します。 オンコジーン 36、2693–2703 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

宮内 明 ほか接着斑の機械感受性アダプターである Hic-5 の欠失によるマウスの変形性関節症の軽減。 科学。 議員9、15770。https://doi.org/10.1038/s41598-019-52301-7 (2019)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

芝沼正史 ほか Hic-5 は、オキシダント感受性の核外輸送シグナルを通じて接着斑と核の間で通信します。 モル。 バイオル。 細胞。 14、1158–1171 (2003)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

レイ、XF 他。 Hic-5 欠損症は、マウスにおける Smad7 の上方制御を通じて肝星細胞の活性化と肝線維化を減弱させます。 Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ． 64、110–117 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Gao、L.ら。 Hic-5 は、慢性膵炎における膵星細胞の活性化と膵線維症の発症に必要です。 科学。 議員 10、19105。https://doi.org/10.1038/s41598-020-76095-1 (2020)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

大本 哲 ほかリジルオキシダーゼ誘導および間質リモデリングを介した結腸直腸癌の腫瘍形成に対する間質 Hic-5 の影響。 オンコジーン 37、1205–1219 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

バーニーSDら。 Hic-5 は、機械的に依存する MRTF-A 核蓄積を調節することにより、筋線維芽細胞の分化に必要です。 Ｊ．Ｃｅｌｌ． 科学。 129、774–787 (2016)。

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim-Kaneyama, J.、Shibauma, M. & Nose, K. LIM タンパク質 Hic-5 による c-fos 遺伝子の転写活性化。 生化学。 生物物理学。 解像度共通。 299、360–365 (2002)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

本村 洋 他選択的 c-Fos/AP-1 阻害剤は、軟骨の破壊とそれに続く骨棘の形成を防ぎます。 生化学。 生物物理学。 解像度共通。 497、756–761 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Huebner, KD、Shrive, NG & Frank, CB デキサメタゾンは、外傷後変形性関節症の新しいモデルにおける炎症と軟骨損傷を抑制します。 J. Orthop. 解像度 32、566–572 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ワン、QSら。 デキサメタゾンを配合した熱感受性ヒドロゲルは、軟骨を保護し、効果的な痛みを軽減することで変形性関節症を軽減します。 アン。 翻訳。 医学。 9、1120。https://doi.org/10.21037/atm-21-684 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

鈴木 義 ほかレバミピドの関節内注射は、マウス外傷後変形性関節症モデルにおける関節軟骨変性を予防します。 モッド。 リウマトール。 30、765–772 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

キム、SE 他。 レバミピドを封入したナノ粒子の関節内注射は、変形性関節症ラットモデルにおける疾患の進行と関節破壊を軽減する：パイロット研究。 軟骨 13、19476035211069250。https://doi.org/10.1177/19476035211069250 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

後藤直也 ほかフルバスタチン-PLGAマイクロスフェアの単回関節内注射は、実験的変形性関節症のウサギの軟骨分解を減少させます。 J. Orthop. 解像度 35、2465–2475 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

田中達也ほかシンバスタチン結合ゼラチンヒドロゲルの関節内投与後のマウスにおける変形性関節症の進行の軽減。 J.組織工学。 リジェネ。 医学。 13、423–432 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ジュネジャ、SC et al. ラットにおける内側半月板切除術の低侵襲的アプローチ: 初期または軽度のヒト変形性関節症を対象としたモデル。 J. Arthritis 5、1000193。https://doi.org/10.4172/2167-7921.1000193 (2016)。

記事 Google Scholar

Gerwin, N.、Bendele, AM、Glasson, S. & Carlson, CS OARSI 組織病理学イニシアチブ - ラットの変形性関節症の組織学的評価に関する推奨事項。 変形性関節症。 カルティル。 18(補足 3)、S24–S34 (2010)。

記事 Google Scholar

プリツカー、KP et al. 変形性関節症の軟骨病理組織学: 等級付けと病期分類。 変形性関節症。 カルティル。 14、13–29 (2006)。

記事 CAS Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

この原稿の草稿の英語テキストを編集してくれた Edanz Group (http://www.edanzediting.com/ac) の Mitchell Arico と RJ Frampton に感謝します。

この研究は、日本学術振興会（XF L. への科研費 17K10713 および Ay. M. への 21K16098）および AMED の助成金番号 JP22fk0210089 の一部により支援されました。

〒142-8555 東京都品川区旗の台1-5-8 昭和大学医学部生化学教室

Aya Miyauchi, Masahito Noguchi, Xiao-Feng Lei, Momoko Kobayashi-Tanabe, Shogo Haraguchi, Akira Miyazaki & Joo-ri Kim-Kaneyama

〒142-8666 東京都品川区旗の台1-5-8 昭和大学医学部消化器内科

Masashi Sakaki

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

研究の構想と設計: JKK および XFL データの取得: Ay.M.、MN、および MKT データの分析と解釈: MS、SH、AM 原稿の起草: Ay.M. JKK が承認した原稿の最終版: すべての著者。

チュリ・キム・カネヤマ氏への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

宮内 明、野口 正、レイ、XF。 他。 機械感受性アダプター Hic-5 をノックダウンすると、MMP-13 の抑制を通じてラットの外傷後変形性関節症が改善します。 Sci Rep 13、7446 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-34659-x

引用をダウンロード

受信日: 2023 年 2 月 18 日

受理日: 2023 年 5 月 4 日

公開日: 2023 年 5 月 8 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34659-x

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供

コメントを送信すると、利用規約とコミュニティ ガイドラインに従うことに同意したことになります。 虐待的なもの、または当社の規約やガイドラインに準拠していないものを見つけた場合は、不適切としてフラグを立ててください。