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Dec 11, 2023

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Volume sulle comunicazioni sulla natura

Nature Communications volume 13、記事番号: 4902 (2022) この記事を引用

3527 アクセス

6 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ポイントオブケア検査機能を備えたラボオンチップシステムは、迅速かつ正確な診断の可能性を提供し、生物医学機器や熟練した専門家がすぐに利用できないリソースが限られた環境で役立ちます。 しかし、多機能の分注、オンデマンド放出、堅牢な動作、試薬の長期保管機能など、必要なすべての機能を同時に備えたポイントオブケア検査システムは、依然として大きな課題です。 ここでは、液体を任意の方向に操作し、加えられた空気圧に正確かつ比例したリリース応答を提供し、急激な動きや振動の際にも堅牢性を維持できるフィルムレバー作動スイッチ技術について説明します。 この技術に基づいて、試薬の導入、混合、反応機能をすべて 1 つのプロセスに統合するポリメラーゼ連鎖反応システムの開発についても説明します。これにより、18 人の患者からのすべての臨床鼻サンプルに対して「サンプルインアンサーアウト」のパフォーマンスが達成されます。インフルエンザと 18 の個別の対照。蛍光強度は標準ポリメラーゼ連鎖反応とよく一致しています (ピアソン係数 > 0.9)。 提案されたプラットフォームは、生物医学分析の強力な自動化を約束するため、さまざまなポイントオブケア検査装置の商品化を加速できます。

何百万もの命の損失をもたらした 2020 年の新型コロナウイルス感染症パンデミックのような、新たな人類の病気は、世界の健康と人類の文明にとって大きな脅威となっています1。 早期、迅速かつ正確な病気の検出は、ウイルスの蔓延を制御し、治療結果の向上を達成するために重要です。 検査サンプルが病院や診断診療所に送られ、専門スタッフによって運営される集中検査室をベースとした主流の診断エコシステムは、現在、世界中で58億人近くの人々、特に高価な生物医学機器がない資源の少ない環境で暮らす人々のアクセスを制限しています。および熟練した臨床医2. したがって、診断と治療に関して十分な情報に基づいた意思決定を行うためのタイムリーな診断情報を医師に提供する、ポイントオブケア検査（POCT）機能を備えた、低コストでユーザーフレンドリーなラボオンチップシステムの開発が非常に望まれています3。

世界保健機関 (WHO) のガイドラインでは、理想的な POCT は、手頃な価格で、ユーザーフレンドリー (最小限のトレーニングで使いやすい)、正確 (偽陰性または偽陽性の結果を回避)、迅速かつ堅牢 (良好な再現性を確保) でなければならないと述べています。 、および成果物（長期保存が可能で、エンドユーザーが簡単に入手できる）4. これらの要件を満たすために、POCT システムは次の機能を提供する必要があります。手動介入を減らすための多機能分注、正確な検査結果を得るために試薬輸送を比例的に制御するオンデマンド放出、および環境からの振動に耐える堅牢な動作です。 現在最も広く使用されている POCT デバイスは、毛細管力を介して事前に固定化された試薬に反応しながら、微量のサンプルを前方に送り出す多孔質ニトロセルロース膜の数層で構成されるラテラル フロー ストリップ 5、6 です。 フローストリップベースの POCT デバイスは、低コストで使いやすく、結果が速いという利点がありますが、多段階の反応を必要とせずにバイオアッセイ (例: 血糖値検査 7,8 や妊娠検査 9,10) にのみ適用できます。 (例: 複数の試薬の充填、混合、多重反応)。 さらに、流体の動きを制御する駆動力（毛細管力）は、特に異なるバッチ間で良好な一貫性を提供しないため、再現性が低くなり 11、ラテラルフローストリップは主に定性的検出に役立ちます 12、13。

高度なマイクロおよびナノスケールの製造能力により、定量測定用のマイクロ流体ベースの POCT デバイスを開発する機会が生まれました 14、15、16、17。 界面特性 18、19 とチャネルの形状 20、21、22 を調整することにより、これらのデバイスの毛細管力と流量を制御できます。 しかし、特に湿潤性の高い液体に対する堅牢性は、製造の不正確さ、材料の不完全さ、環境振動の影響を受けやすいため、依然として許容できるものではありません 23。 さらに、毛細管流は液体と空気の界面で生成されるため、特にマイクロ流体チャネルが液体で満たされた後は、追加の流れを導入することができません。 その結果、より複雑なアッセイを達成するには、いくつかのサンプル導入ステップを実行する必要があります 24,25。

マイクロ流体デバイスの中で、遠心マイクロ流体デバイスは現在、最良の POCT ソリューションの 1 つです 26,27。 その駆動機構は有利であり、回転周波数を調整することによって作動力を制御できる。 ただし、遠心力が常にデバイスの外側の縁に向けられるため、より複雑なアッセイに必要な多段階反応を達成することが困難になるという欠点があります。 多機能の分注を達成するために、遠心力に加えて追加の作動力（例えば、毛細管28、29、とりわけ毛細管28、2930、31、32、33、34、35）が導入されても、これらの追加の力は、依然として意図しない液体輸送が発生する可能性がある。ほとんどの場合、遠心力よりも桁違いに小さいため、狭い動作範囲でのみ有効であるか、オンデマンドの液体放出の使用が不可能になります。 遠心マイクロ流体工学における空気圧操作、たとえば、遠心力学的方法 36、37、38、熱空気圧方法 39、能動空気圧方法 40 の組み合わせは、魅力的な代替手段であることが示されています。 遠心力学法では、追加のキャビティと接続するマイクロチャネルがデバイスに統合されており、外側と内側の両方の操作が可能ですが、そのポンピング効率 (75 ～ 90% の範囲) はポンピング サイクル数と粘度に大きく依存します。液体の。 熱空気圧法では、ラテックス膜と液体移行チャンバーは、閉じ込められた空気量が加熱または冷却されたときに入口を密閉または再開するように特別に設計されています。 ただし、加熱/冷却設定は作動が遅いという問題を引き起こし、熱に敏感なアッセイ (ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 増幅など) での使用が制限されます。 アクティブ空気圧方式では、高速モーターによって可能になる正圧と正確に一致した回転速度を同時に適用することにより、オンデマンドの流体放出と内側への操作が実現されます。 他にも、空気圧駆動機構 (正圧 41、42 または負圧 43) と常閉バルブ構造のみを使用する成功した方法があります。 空気圧チャンバー内に圧力を順次加えることで、液体は蠕動運動で前方に送り出され、常閉バルブが液体の逆流を防ぎ、複雑な流体操作が可能になります。 しかし、現在、単一の POCT デバイスで複雑な流体ハンドリングを実行できるマイクロ流体技術は限られています。これには、多機能の分注、オンデマンド放出、堅牢な動作、長期保管、高粘度液体のハンドリング、およびコスト効率の高い製造が含まれます。 —すべて同時に。 マルチステップ機能の動作が欠如していることも、これまでに少数の商用 POCT 製品 (Cepheid、Binx、Visby、Cobas Liat、Rhonda など) しか公開市場で採用されていない理由の 1 つである可能性があります。

この論文では、フィルムレバー作動スイッチ技術 (FAST) に基づいた一種の空気圧マイクロ流体駆動機構を紹介しました。 FAST は必要なすべての特性を同時に組み込んでおり、マイクロリットルから数ミリリットルまでの範囲の試薬を処理できます。 FASTは弾性フィルム、レバー、ブロックで構成されています。 空気圧がかかっていない状態ではフィルム、レバー、ブロックを密閉し、内部の液体を長期保存することができます。 レバーの長さに応じて調整可能な適切な圧力が加えられると、フィルムが膨張してレバーを押し開いて液体が流れます。 これにより、カスケード式、同時式、順次式、または選択的な方法での液体の多機能ディスペンスが可能になります。

我々は、インフルエンザ A および B ウイルス (IAV および IBV) 検出のための「サンプル・イン・アンサー・アウト」結果を実現する、FAST を使用した PCR システムを開発しました。 当社は 102 コピー/ml の検出下限 (LOD) を達成し、多重化テストにより IAV および IBV に対する特異性が実証され、インフルエンザ ウイルスの病型解析能力が得られました。 患者 18 名と健康な個人 18 名からの鼻腔スワブサンプルを使用した臨床検査結果は、蛍光強度が標準 RT-PCR と良好に一致していることを示しています (ピアソン係数 > 0.9)。 FAST-POCT デバイスの推定材料費は約 1 ドル (補足表 1) ですが、大量製造方法 (金型射出など) を使用するとさらに削減できます。 実際的には、FAST ベースの POCT デバイスは、WHO が想定している必要な特性をすべて備えており、プラズモニック熱サイクル検査 44、無増幅イムノアッセイ 45、ナノボディ機能化検査 46 などの新たな生化学検査法と互換性があり、POCT システムの機会を示唆しています。 。

図 1a は、4 つの流体チャンバー (予備保管チャンバー、混合チャンバー、反応チャンバー、および廃棄チャンバー) で構成される FAST-POCT プラットフォームの構造を示しています。 流体の流れを制御するための重要な要素は、予備保管チャンバーと混合チャンバーにある FAST 構造 (弾性フィルム、レバー、ブロックで構成される) です。 空気圧駆動方式として、FAST 構造により、密封状態と開放状態の間の切り替え、多機能の分注、オンデマンドの流体放出、堅牢な動作 (環境振動の影響を受けないなど)、長期にわたる流体の流れの正確な制御が可能になります。ストレージ。 FAST-POCTプラットフォームは、図1bの拡大図に見られるように、基板層、弾性フィルム層、プラスチックフィルム層、カバー層の4つの層で構成されています（補足図S1およびS2でも詳細に説明されています）。 すべての液体輸送チャネルおよびチャンバー（例えば、予備貯蔵チャンバーおよび反応チャンバー）は、厚さ0.2 mm（最薄部）から5 mmのPLA（ポリ乳酸）製の基板上に統合されています。 弾性フィルムの材質は PDMS で、厚さは 300 μm で、「厚みが薄く」弾性率が小さい（約 2.25 MPa47）ため、空気圧が加わると容易に伸びます。 プラスチック フィルム層は厚さ 100 μm のポリエチレン テレフタレート (PET) でできており、弾性フィルムが空気圧による過度の変形から保護するために使用されます。 基板層のチャンバーに対応して、液体の流れを制御するためにヒンジを介してカバー層 (PLA 製) に接続するレバーがあります。 弾性フィルムは両面接着テープ (ARseal 90880) で基材層に貼り付けられ、プラスチック フィルムで覆われます。 T 字型のクリップ構造がカバー層で使用され、基板上に 3 つの層が組み立てられます。 T 字型クリップは 2 本の脚の間に隙間があります。 クリップを溝に押し込むと、2つの脚がわずかに曲がり、溝を通過すると元の状態に戻り、カバーと基板をしっかりと結合します（補足図S1）。 次に、コネクタを使用して 4 つの層を組み立てます。

a さまざまな機能チャンバーと FAST の機能を示すプラットフォームの概略図。 b FAST-POCT プラットフォームの展開図。 c 米国の 4 分の 1 コインの隣にあるプラットフォームの写真。

FAST-POCT プラットフォームの動作メカニズムを図 2 に示します。主要なコンポーネントは基板層のブロックとカバー層のヒンジで、4 つの層が T-形状のクリップ構造。 空気圧がかかっていないとき（図 2a）、締まりばめによりヒンジが曲げ変形し、レバーを介してシール力が作用して弾性フィルムがブロックに押し付けられ、チャンバー内の液体がシールされます。密閉状態と定義します。 図２ａの側面図からわかるように、この状態ではレバーが外側に曲がっていることに留意されたい。 空気圧がかかると (図 2b)、弾性フィルムが外側にカバー層まで膨張し、レバーを押し上げます。 したがって、レバーとブロックの間に隙間が開き、液体が次の部屋に流れることができるようになり、これが開いた状態と定義されます。 空気圧が取り除かれると、レバーはヒンジの弾性特性により元の位置に回復し、密閉状態を維持します。 レバーの動きのビデオは補足ムービー S1 にあります。

密閉状態の模式図と写真。 圧力が加えられていない場合、レバーがフィルムをブロックに押し付け、液体が密封されます。 b 開いた状態。 圧力がかかるとフィルムが膨張してレバーを押し上げ、流路が開き液体が流れるようになります。 c 臨界圧力を決定する特徴的なサイズ。 特徴的なサイズには、レバーの長さ (L)、ブロックとヒンジの間の距離 (l)、およびレバーの突出厚さ (t) が含まれます。 Fs はブロック点 B でのシール力です。q はレバーにかかる等分布荷重です。 Tx* は、レバーによって発生するヒンジ部分のトルクを示します。 臨界圧力とは、レバーを押し上げて液体を流すのに必要な圧力を意味します。 d 臨界圧力と特性サイズの関係に関する理論的および実験的結果。 n = 6 回の独立した実験が行われ、データは ± sd として示されています。ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

ビーム理論に基づく解析モデルは、幾何学的パラメータの関数としてギャップが開く臨界圧力 Pc を解析するために次のように開発されます (例: L はレバーの長さ、l はブロックとヒンジの間の距離) 、S はレバーと液体の接触面積、t は図 2c) に示すレバーの突出厚さです。 補足注と補足図 S3 で詳しく説明されているように、\({P}_{c}\ge \frac{2{F}_{s}l}{SL}\) のときにギャップが開きます。ここで、Fs はシーリングですしまりばめに関係する力であり、ヒンジの曲げ変形によって発生するトルク \({T}_{x}^{\ast }(={F}_{s}l)\) を導きます。 実験的特性評価と解析モデルは良好な一致を示し（図2d）、臨界圧力Pcはt / lの増加とLの減少に伴って増加することを示しています。これは古典的なビームモデルによって容易に説明できます。つまり、トルクはtとともに増加します。 /l. したがって、私たちの理論分析は、レバーの長さ L と t/l 比を調整することで臨界圧力を効果的に調整できることを明確に示しており、FAST-POCT プラットフォームの設計に重要な基礎を提供します。

FAST-POCT プラットフォームにより、多機能の分注が可能になります (図 3a の図と実験を参照)。これは、POCT を成功させるための最も重要な機能であり、液体を任意の方向およびカスケード、同時、連続のいずれかの順序で操作できます。 、または選択的な多機能ディスペンシング。 図 3a(i) は、異なる試薬を分離するブロックと開閉状態を制御する 1 つのレバーを使用して、2 つ以上のチャンバーがカスケード方式で接続されるカスケード分注モードを示しています。 圧力が加えられると、液体は上部のチャンバーから下部のチャンバーへカスケード状に流れます。 カスケードチャンバーには湿式化学薬品または凍結乾燥粉末などの乾式化学薬品を充填できることに注意してください。 図 3a(i) の実験では、上部チャンバーからの赤色インクが青色染料粉末 (硫酸銅) を含む 2 番目のチャンバーに流れ、下部チャンバーに到達すると濃い青色になりました。 ここでは、注入される液体に対する制御圧力も示します。 同様に、1つのレバーを2つのチャンバーに接続すると、図3a(ii)に示すように、圧力を加えたときに液体を2つ以上のチャンバーに均等に分配できる同時注入モードになります。 臨界圧力はレバーの長さに依存するため、図 3a(iii) に示すように、レバーの長さを調整して逐次噴射モードを実現できます。 長いレバー (臨界圧力 Pc_long) がチャンバー B に接続され、短いレバー (臨界圧力 Pc_short > Pc_long) がチャンバー A に接続されました。圧力 P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) が加えられると、赤色の液体のみが発生しました。青い液体はチャンバー B に流れることができ、圧力が P2 (> Pc_short) に増加すると、青い液体はチャンバー A に流れることができます。この連続注入モードは、関連するチャンバーに順番に移送されるさまざまな液体に適用されます。これは、POCT を成功させるために重要です。デバイス。 図 3a(iv) は選択噴射モードを示しています。メイン チャンバーには短いレバー (臨界圧力 Pc_short の場合) と長いレバー (臨界圧力 Pc_long < Pc_short の場合) があり、それぞれチャンバー A とチャンバー B に接続されています。液体をチャンバー A に移送するために、最初に圧力 P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) と P2 (P2 > P1) (P1 + P2 > Pc_short) を同時にデバイスに加えました。 このようにして、液体は P2 によってチャンバー B に入るのをブロックされました。 その間、全圧力 P1 + P2 が臨界圧力を超え、チャンバー A に接続された短いレバーが作動してチャンバー A に液体が流れるようになりました。その後、チャンバー B を充填する必要がある場合は、P1 (Pc_long <メインチャンバー内で P1 < Pc_short) になると、長いレバーが作動し、液体がチャンバー B に流れるようになります。時間 t = 3 秒から 9 秒まで、チャンバー A 内の液体が一定のままである一方で、チャンバー内で液体が増加していることがはっきりと観察できます。圧力 P1 を加えた場合は B。 チャンバー A を再度充填する必要がある場合は、メイン チャンバーに P1 を適用し、追加チャンバーに P2 を適用するだけで済みます。 このようにして、チャンバー A と B の間で流れの動作を選択的に切り替えることができます。4 つの多機能分注モードの流れの動作は、補足ムービー S2 でご覧いただけます。

a 多機能ディスペンシング、すなわち (i) カスケード、(ii) 同時、(iii) 順次、および (iv) 選択的ディスペンスの図。 曲線は、これら 4 つの塗布モードの作業プロセスとパラメータを示しています。 b 脱イオン水とエタノールの長期保存テストの結果。 n = 5 回の独立した実験が行われ、データは ± sd c として示されています。 FAST デバイスとキャピラリー バルブ (CV) ベースのデバイスが (i) 静的状態および (ii) 振動状態にある場合の堅牢性テストの実証。 (iii) 異なる角振動周波数における FAST デバイスと CV デバイスの体積対時間。 d (i) FAST デバイスおよび (ii) CV デバイスのオンデマンド リリース テストの結果。 (iii) 間欠圧力モードを使用した FAST デバイスおよび CV デバイスの体積と時間の関係。 スケール バーはすべて 1 cm。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

試薬の長期保管は、POCT 装置の成功に不可欠なもう 1 つの特徴であり、訓練を受けていない担当者でも複数の試薬を扱うことができます。 多くの技術は長期保存の可能性を示していますが（マイクロディスペンサー 35、ブリスター 48、スティックパッケージ 49 など）、パッケージを保持するには特別な受け取りチャンバーが必要であり、それによりコストと複雑さが増加します。 さらに、これらの保管メカニズムはオンデマンドの放出を可能にせず、パッケージ内の残留物による試薬の損失につながります。 長期保存の能力は、粗さが小さくガス透過に対する耐性があるため、CNC技術で製造されたPMMA材料を使用して加速寿命試験を行うことによってテストされました（補足図S5）。 試験装置には、脱イオン水 (脱イオン水) と 70% エタノール (揮発性試薬をシミュレートするため) を 65 °C で 9 日間充填しました。 脱イオン水とエタノールは両方とも、上部の入り口を密閉するためにアルミホイルを使用して保管されました。 文献 50,51 で報告されているアレニウス方程式と浸透の活性化エネルギーを適用して、同等のリアルタイムを計算しました。 図 3b は、65 °C で 9 日間維持した 5 つのサンプルの平均重量損失の結果を示しています。これは、23 °C で 2 年間以上の脱イオン水の場合は 0.30%、70% エタノールの場合は 0.72% に相当します。

図 3c は、振動下での堅牢性テストを示しています。 キャピラリーバルブ (CV) は既存の POCT デバイスで最も一般的な液体操作技術である 28,29 ため、比較には幅 300 μm、深さ 200 μm の CV デバイスが使用されます。 両方のデバイスを静止させた場合、FAST-POCT プラットフォーム内の液体は密閉され、CV デバイスの液体はチャネルの急激な拡張により固定され、毛細管力が減少したことが観察されます。 ただし、オービタルシェーカーの角振動周波数が増加すると、FAST-POCT プラットフォーム内の液体は密閉されたままですが、CV デバイス内の液体は下部チャンバーに流れました (補足ムービー S3 も参照)。 これは、FAST-POCT プラットフォームの変形したヒンジがブロックに強力な機械力を与え、チャンバー内の液体をしっかりと密閉できることを示唆しています。 ただし、CV デバイスの場合、固体、空気、液相間の平衡により液体が固定されるため、不安定性が生じ、振動によって平衡が崩れ、意図しない流動挙動が発生する可能性があります。 FAST-POCT プラットフォームの利点は、堅牢な機能を提供し、通常は配送時や動作中に発生する振動による動作障害を回避できることです。

FAST-POCT プラットフォームのもう 1 つの重要な特徴は、定量分析における重要な要件であるオンデマンド リリースのパフォーマンスです。 図 3d は、FAST-POCT プラットフォームと CV デバイスの両方のオンデマンド リリースを比較しています。 図 3d(iii) から、FAST デバイスが圧力信号に対して迅速に応答することがわかります。 FAST-POCT プラットフォームに圧力を加えると、液体が流れました。 圧力が解除されると、流れはすぐに止まりました (図 3d(i))。 この動作は、ヒンジの素早い弾性回復によるものと考えられ、これによりレバーがブロックに押し戻され、チャンバーが密閉されます。 ただし、CV デバイスでは、液体は流れ続け、圧力が解除されたときに最後に約 100 μl の意図しない液体量が発生します (図 3d(ii) および補足ムービー S4)。 これは、最初の注入後の CV が完全に濡れたときに毛細管ピン止め効果が消失したことに起因すると考えられます。

POCT アプリケーションでは、湿潤性と粘度が異なる液体を同じデバイス内で処理できるかどうかが依然として課題です。 湿潤性が低いと、チャネル内で漏れやその他の意図しない流動現象が発生する可能性があり、高粘度の液体の調製にはボルテックスミキサー、遠心分離機、ストレーナーなどの補助機器が必要になることがよくあります52。 臨界圧力と液体の特性 (幅広い濡れ性と粘度) の関係をテストしました。 結果を表１およびムービーＳ５に示す。 濡れ性や粘度の異なる液体をすべてチャンバー内に密閉でき、圧力を加えると5500cPもの高粘度の液体も次のチャンバーに移送できることがわかります。高粘度のサンプル検査（つまり、呼吸器疾患の診断に使用される高粘度の検体である喀痰）が可能です。

前述の多機能分注ユニットを組み合わせることで、幅広い FAST ベースの POCT デバイスを開発できます。 図 1 に示すような一例を示しました。このユニットには、予備保管チャンバー、混合チャンバー、反応チャンバー、および廃棄チャンバーが含まれています。 反応試薬は予備保管チャンバーに長期間保管でき、その後混合チャンバーに放出できます。 適切な圧力が加えられると、混合試薬は選択的に廃棄チャンバーまたは反応チャンバーに移送されます。

PCR 検査は病原体検出 (H1N1 や COVID-19 など) のゴールドスタンダードであり、複数の反応ステップが必要となるため、アプリケーションとして PCR 検査用の FAST-POCT プラットフォームを使用しました。 図4は、FAST-POCTプラットフォームを使用したPCR検査手順を示しています。 まず、溶出試薬、磁性マイクロビーズ試薬、洗浄溶液 A、および洗浄溶液 W を、それぞれ予備保管チャンバー E、M、W1、および W2 にピペットで移しました。 RNA 吸着ステップを図 4a に示します。 (1) サンプルをピペットで M チャンバーに移し、圧力 P1 (= 0.26 bar) を加えたときに混合チャンバーに放出します。 (2) 空気圧 P2 (= 0.12 bar) を、混合チャンバーの底部に接続されたチャンネル A を通じて加えました。 多くの混合技術が POCT プラットフォームでの液体混合の可能性を示していますが (例えば、サーペンタイン混合 53、カオス混合 54、バッチモード混合 55)、それらの混合効率と有効性はまだ満足のいくものではありません。 ここでは、混合室の底部に空気を導入して液体中に気泡を発生させる気泡混合法を採用しています。 強力な渦により、数秒以内に完全な混合パフォーマンスが可能になります。 気泡混合実験が実行され、その結果が補足図S6に示されています。 0.10 bar の圧力を加えた場合、完全な混合が完了するまでに約 8 秒かかったことがわかります。 圧力が 0.20 bar まで増加すると、完全に混合するまでにわずか約 2 秒しかかかりませんでした。 混合効率を計算する方法は、方法セクションに記載されています。 (3) ルビジウム磁石を使用してマイクロビーズを抽出し、続いて P チャネルを介して圧力 P3 (= 0.17 bar) を加えて試薬を廃棄チャンバーに移しました。 図 4b、c は、サンプルから不純物を除去するために次のように実行された洗浄ステップを示しています。 (1) W1 チャンバーからの洗浄 A 溶液は、圧力 P1 を使用して混合チャンバーに放出されました。 （２）次に、泡混合処理を行った。 （３）洗浄Ａ溶液を廃棄チャンバーに移し、マイクロビーズを混合チャンバー内で磁石によって抽出した。 洗浄 W プロセス (図 4c) は洗浄 A (図 4b) と同様です。 なお、洗浄Ａ、Ｗの各工程は２回ずつ行った。 図 4d は、RNA がマイクロビーズから溶出される溶出ステップを示しています。 溶出注入および混合工程は、上記のRNAの吸着および洗浄工程と同様である。 溶出試薬が PCR 反応チャンバーに移送されたため、圧力 P3 と P4 (= 0.23 bar) が同時に適用され、PCR 反応チャンバーを密閉するためのレバーの臨界圧力に達しました。 同様に、圧力 P4 も廃棄物チャンバーにつながるチャネルを密閉するのに役立ちます。 したがって、マルチプレックス PCR 反応を誘発するために、すべての溶出試薬が 4 つの PCR 反応チャンバーに均等に分配されました。 以上の処理は補足動画Ｓ６に設けられている。

RNA 吸着ステップでは、サンプルが M インレットに導入され、事前に保存されているマイクロビーズ溶液とともに混合チャンバーに注入されます。 混合およびビーズ抽出後、試薬は廃棄チャンバーに分注されます。 b、c 洗浄ステップでは、事前に保存されたさまざまな洗浄試薬が混合チャンバーに注入され、混合とビーズ抽出の後、試薬は廃棄チャンバーに移されます。 d 溶出ステップ。溶出試薬を注入し、混合およびビーズ抽出後、試薬を PCR 反応チャンバーに移します。 曲線は、さまざまなステップでの作業プロセスと関連パラメータを示します。 圧力は、さまざまなチャンバーを通して加えられる圧力です。 体積は、混合チャンバー内の液体の体積です。 スケールバーはすべて 1 cm です。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

PCRテストプロセスが実行され、熱プロファイルが補足図S7に示されています。これには、20分の逆転写時間と60分のサーモサイクル時間（95および60℃）が含まれ、1つのサーモサイクルは90秒です（補足）映画S7）。 FAST-POCT では、1 つの熱サイクルを完了するのにかかる時間が従来の RT-PCR (1 つの熱サイクルで 180 秒) よりも短くなります (90 秒)。 これは、マイクロスケール PCR 反応チャンバーの高い表面積対体積比と小さい熱慣性によるものと考えられます。 チャンバー表面積は 96.6 mm2、チャンバー容積は 25 mm3 で、表面積対容積比は約 3.86 になります。 補足図 S10 では、プラットフォームの PCR テスト領域の背面に溝があり、PCR チャンバーの底部の厚さを 200 μm にしていることがわかります。 温調ユニットの発熱面には伝熱弾性パッドが貼付されており、試験室裏面に密着します。 これにより、プラットフォームの熱慣性が低減され、冷暖房効率が向上します。 熱サイクルプロセス中に、プラットフォームに埋め込まれたパラフィンワックスが溶けて PCR 反応チャンバーに流れ込み、試薬の蒸発や環境汚染を防ぐ封止物質として機能しました (補足ムービー S8 を参照)。

上記のすべての PCR 検査プロセスは、プログラムされた圧力制御ユニット、磁気抽出ユニット、温度制御ユニット、蛍光シグナル捕捉および処理ユニットで構成されるカスタマイズされた FAST-POCT 装置を使用して完全に自動化されました。 RNA抽出にはFAST-POCTプラットフォームを使用し、抽出したRNAサンプルを使用してFAST-POCTシステムとベンチトップPCRシステムを使用してPCR反応を実行し、比較したことに注意してください。 結果は、補足図S8に示すようにほぼ同じです。 オペレーターは、サンプルを M チャンバーに注入し、プラットフォームを機器に挿入するという簡単な作業を実行します。 約 82 分後に定量的テスト結果が得られます。 FAST-POCT 機器に関する詳細情報は、補足図に記載されています。 S9、S10、S11。

インフルエンザ ウイルス A (IAV)、B (IBV)、C (ICV)、および D (IDV) によって引き起こされるインフルエンザは、世界的によく見られる現象です。 これらの中で、IAV と IBV は、ほとんどの重症例と季節性流行の原因となっており、世界人口の 5 ～ 15% が感染し、300 万～500 万人の重症例を引き起こし、毎年 29 万～65 万人が死亡しています。呼吸器疾患56,57。 IAV および IBV の早期診断は、罹患率とそれに伴う経済的負担を軽減するために重要です。 利用可能な診断技術の中で、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) が最も感度が高く、特異的で正確 (>99%) であると考えられています 58,59。 しかし、従来のRT-PCR技術では、数回のピペット操作、混合、計量、液体移送操作が必要であり、リソースが限られた環境では専門スタッフのアクセスが制限されていました。 ここでは、FAST-POCT プラットフォームを IAV と IBV の PCR 検査に個別に適用して、検出下限 (LOD) を取得しました。 さらに、種の異なる病型を区別するために IAV と IBV の多重検査が実施され、有望な遺伝子解析プラットフォームと疾患の正確な治療の機会が提供されました。

図5aは、サンプルとして150μlの精製ウイルスRNAを使用したIAVのPCR検査結果を示しています。 図 5a(i) は、IAV の濃度が 106 コピー/ml の場合、蛍光強度 (ΔRn) が 0.830 になる可能性があり、濃度が 102 コピー/ml に減少しても、ΔRn が依然として 0.365 と高くなる可能性があることを示しています。ブランク陰性対照群 (0.002) よりも約 100 倍高かった。 定量分析では、6 回の別々の実験に基づいて、102 ～ 106 コピー/ml の範囲で R2 = 0.993 の IAV の対数濃度とサイクル閾値 (Ct) の間の直線検量線が得られました (図 5a(ii))。 。 これらの結果は、従来の RT-PCR 技術とよく一致しています。 図 5a(iii) は、FAST-POCT プラットフォームからの 40 サイクル後のテスト結果の蛍光画像を示しています。 FAST-POCT プラットフォームでは 102 コピー/ml もの IAV を検出できることがわかりました。 しかし、従来法では 102 コピー/ml の濃度では Ct 値が得られず、LOD は約 103 コピー/ml となります。 これは気泡の混合効率が高いためと考えられます。 精製された IAV RNA の PCR テスト実験は、振盪混合 (従来の RT-PCR 操作と同じ混合方法)、バブル混合 (本方法、0.12 bar の圧力で 3 秒)、および対照群として混合せずに。 結果は補足図S12に示されています。 RNA 濃度が高い場合 (106 コピー/ml)、さまざまな混合方法の Ct 値がバブル混合の Ct 値とほぼ同じであることがわかります。 RNA 濃度が 102 コピー/ml に減少すると、振盪混合法と対照群は Ct 値を示さなくなりましたが、バブル混合法では依然として Ct 値 36.9 が得られ、これは閾値 Ct 値 38 を下回りました。結果は利点を示しています。これは他の文献60でも実証されており、FAST-POCTプラットフォームが従来のRT-PCRよりわずかに高い感度を有する理由も説明できる可能性があります。 図 5b は、濃度範囲 101 ～ 106 コピー/ml の精製 IBV RNA サンプルの PCR 検査結果を示しています。 結果は、R2 = 0.994 および 102 コピー/ml の LOD を達成した IAV テストと同様です。

a 陰性対照 (NC) として TE バッファーを使用した、A 型インフルエンザウイルス (IAV) 濃度範囲 106 ～ 101 コピー/ml の PCR 検査の結果。 (i) リアルタイムの蛍光プロファイル。 (ii) FAST と従来の検査技術の両方について、IAV RNA の対数濃度とサイクル閾値 (Ct) の間の直線検量線。 (iii) 40 サイクル後の IAV を使用した FAST-POCT の蛍光画像。 b、(i) リアルタイム蛍光プロファイルによる B 型インフルエンザウイルス (IBV) の PCR 検査結果。 (ii) 直線検量線および (iii) 40 サイクル後の IBV による FAST-POCT の蛍光画像。 FAST-POCT プラットフォームを使用した IAV および IBV の検出下限 (LOD) は 102 コピー/ml であり、従来の方法 (103 コピー/ml) よりも低くなります。 c IAV および IBV の複数の検出結果。 可能性のある汚染およびバックグラウンド増幅を防ぐために、GAPDH をポジティブコントロールとして使用し、TE バッファーをネガティブコントロールとして使用しました。 4 つの異なるタイプのサンプルを識別できます。(1) GAPDH のみを含む陰性サンプル (「IAV-/IBV-」)。 （２）ＩＡＶおよびＧＡＰＤＨに感染した（「ＩＡＶ＋／ＩＢＶ−」）。 (3) IBVおよびGAPDHに感染したIBV(「IAV-/IBV+」)。 (4) IAV、IBV、およびGAPDHに感染したIAV/IBV(「IAV+/IBV+」)。 点線は閾値ラインを示します。 n = 6 の生物学的に独立した実験が行われ、±sd として示されるデータが使用されました。ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

図 5c は、IAV/IBV の多重化テストの結果を示しています。 ここでは、精製 RNA の代わりにウイルス溶解物をサンプル溶液として使用し、IAV、IBV、GAPDH (ポジティブ コントロール)、および TE バッファー (ネガティブ コントロール) をターゲットとする 4 つのプライマーを FAST-POCT の 4 つの異なる反応チャンバーに追加しました。プラットホーム。 ここで使用されるポジティブコントロールとネガティブコントロールは、汚染の可能性やバックグラウンドの増幅を防ぐためのものです。 検査は 4 つのグループに分類されました。(1) GAPDH のみを含む陰性サンプル (「IAV-/IBV-」)。 （２）ＩＡＶおよびＧＡＰＤＨに感染した（「ＩＡＶ＋／ＩＢＶ−」）。 (3) IBVおよびGAPDHに感染したIBV(「IAV-/IBV+」)。 (4) IAV、IBV、およびGAPDHに感染したIAV/IBV(「IAV+/IBV+」)。 図5cは、ネガティブサンプルを適用した場合、ポジティブコントロールチャンバーは0.860の蛍光強度ΔRnを示し、IAVおよびIBVのΔRnはネガティブコントロールのΔRn（0.002）と同様であったことを示しています。 IAV+/IBV-、IAV-/IBV+、および IAV+/IBV+ グループでは、IAV/GAPDH、IBV/GAPDH、および IAV/IBV/GAPDH チャンバーがそれぞれ有意な蛍光強度を示し、他のチャンバーはバックグラウンド レベルの蛍光強度を示しました。 40回の熱サイクル後。 上記のテストから、FAST-POCT プラットフォームは顕著な特異性を示し、さまざまなインフルエンザ ウイルスの病型を一度に分類できることがわかりました。

FAST-POCTの臨床応用性を検証するために、IBV患者（n = 18）とIBVを持たない対照個人（n = 18）からの36の臨床サンプル（鼻腔スワブサンプル）をテストしました（図6a）。 患者情報は補足表3に記載されています。IBV感染状態は独自に確認され、研究プロトコールは浙江大学第一附属病院（浙江省杭州）によって承認されました。 各患者サンプルは 2 つのカテゴリーに分類されました。 1 つのアリコートは FAST-POCT を使用して処理され、もう 1 つはベンチトップ PCR システム (SLAN-96P、中国) を使用して処理されました。 どちらのアッセイでも同じ精製キットと検査キットを使用しました。 図6bは、FAST-POCTおよび逆転写を伴う従来のPCR（RT-PCR）の結果を示しています。 蛍光強度（FAST-POCT）を-log2（Ct）と比較しました。ここで、Ctは従来のRT-PCRのサイクルカットオフです。 これら 2 つの方法の間には良好な一致が観察されました。 FAST-POCTおよびRT-PCRは、0.90のピアソン係数（r）値との強い正の相関を示しました（図6b）。 次に、FAST-POCT の診断精度を評価しました。 独立した分析尺度として、陽性サンプルと陰性サンプルの両方の蛍光強度 (FL) 分布が提供されます (図 6c)。 IBV患者のFL値は、対照群よりも有意に高かった（****P = 3.31×10−19;両側t検定）（図6d）。 IBV については、受信者動作特性 (ROC) 曲線がさらに作成されました。 診断精度は優れており、曲線下面積は 1 であることがわかりました (図 6e)。 2020年以降、中国では新型コロナウイルス感染症によるマスクの注文が義務付けられているため、IAV患者は見つからなかったことにご注意ください。 その結果、陽性の臨床サンプル (つまり、鼻腔スワブサンプル) はすべて IBV のみのものになります。

臨床研究のデザイン。 18 人の患者のサンプルと 18 人のインフルエンザに罹患していない対照個人を含む、合計 36 のサンプルが FAST-POCT プラットフォームと従来の RT-PCR によって分析されました。 b FAST-POCT PCR と従来の RT-PCR の間の分析的一致性の評価。 結果は正の相関がありました (ピアソンの r = 0.90)。 c IBV患者18名と対照18名の蛍光強度レベル。 d FL 値は、対照 (-) よりも IBV 患者 (+) で有意に高かった (****P = 3.31 × 10−19; 両側 t 検定; n = 36)。 各箱ひげ図では、中央の黒いマークは中央値を示し、箱の一番下の線と上の線はそれぞれ 25 パーセンタイルと 75 パーセンタイルを示します。 ひげは、外れ値とみなされなかった最小値と最大値のデータ ポイントまで伸びています。 e ROC 曲線。 点線 d は、ROC 分析から推定されたカットオフを示します。 IBVのAUCは1でした。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

この論文では、理想的な POCT に必要な機能を備えた FAST を実証しました。 当社のテクノロジーの利点は次のとおりです。(1) 多機能ディスペンス (カスケード、同時、順次、選択的な方法)、オンデマンド放出 (加えられた圧力に応じて迅速かつ比例的に放出)、および堅牢な動作 (150 度の振動下でも漏れなし)ラジアン/分); (2) 長期保管 (約 0.3% の重量減少を伴う 2 年間の加速寿命試験)。 （３）広範囲の湿潤性および粘度（粘度は５５００ｃｐもの高さ）の液体を取り扱う能力。 (4) 費用対効果 (FAST-POCT PCR 装置の推定材料費は約 1 ドル)。 多機能の分注ユニットを組み合わせることで、統合された FAST-POCT プラットフォームが実証され、インフルエンザ A 型および B 型ウイルスの PCR 検査に適用されました。 IAV および IBV は、102 コピー/ml の LOD を使用して in situ で検出でき、FAST-POCT プラットフォームでの IAV および IBV のワンステップ病型判定は 82 分で完了しました。 36 個の鼻腔スワブサンプルを用いた臨床試験では、蛍光強度が標準 RT-PCR と良好に一致していることが示されました (ピアソン係数 > 0.9)。 この研究と並行して、さまざまな新たな生化学技術 (すなわち、プラズモニック熱サイクル試験、無増幅イムノアッセイ、およびナノボディ機能化試験) が POCT の可能性を示しています。 しかし、すべてが統合された堅牢な POCT プラットフォームが欠如しているため、これらの技術には必然的に個別の前処理プロセス (例、RNA 抽出 44、インキュベーション 45、およびリンス 46) が必要となり、そのため、現在の研究は高度な技術を達成するためにこれらの技術をさらに補完するものとなっています。望ましい「サンプルインアンサーアウト」パフォーマンスを備えた POCT 機能。 この研究では、FASTバルブを作動させるために使用される空気圧ポンプはサイズが小さく、ベンチトップ機器に統合できますが（図S9、S10）、それでもかなりの電力を消費し、騒音が発生します。 原理的には、空気圧ポンプは、電磁力や指で作動する力の使用など、より小さなフォームファクタを実現するための他の手段に置き換えることができます。 さらなる改善には、たとえば、さまざまな特定の生化学アッセイ用にカートリッジをカスタマイズすることや、加熱/冷却システムを必要としない新しい検出方法を採用することが含まれ、PCR アプリケーション向けの機器不要の POCT プラットフォームが実現します。 FASTプラットフォームが流体を操作する手段を提供することを考えると、提案されたFAST技術は、生物医学検査だけでなく、環境モニタリング、食品品質検査、材料合成、および医薬品の普遍的なプラットフォームを確立する可能性を示すものであると信じています。

ヒト鼻腔ぬぐい液サンプルの収集と使用は、浙江大学第一付属病院の倫理委員会によって承認されました (IIT20220330B)。 30 歳未満の成人 16 名、40 歳以上の成人 7 名、男性 19 名、女性 17 名を含む 36 件の鼻腔スワブサンプルが収集されました。 人口統計は補足表 3 に示されています。すべての参加者からインフォームドコンセントが得られました。 参加者は全員インフルエンザの疑いのある人で、無償で検査を受けることを志願した。

FAST の基板とカバーはポリ乳酸 (PLA) 素材で作られ、Ender 3 Pro 3D プリンター (Shenzhen Creality 3D Technology Co. Ltd.) を使用して 3D プリントされました。 両面接着剤は Adhesives Research, Inc. から購入し、モードは 90880 です。厚さ 100 μm の PET フィルムは McMaster-Carr から購入しました。 接着剤およびＰＥＴフィルムは両方とも、Ｓｉｌｈｏｕｅｔｔｅ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．のＳｉｌｈｏｕｅｔｔｅ Ｃａｍｅｏ ２ カッターを使用して切断した。弾性フィルムは、モールドキャスティング法を使用してＰＤＭＳ材料で作製した。 まず、厚さ200μmのPETフレームをレーザー装置で切断し、厚さ3mmのPMMAシートに厚さ100μmの両面テープで貼り付けました。 次に、ＰＤＭＳ前駆体（Ｓｙｌｇａｒｄ １８４；パートＡ：パートＢ＝１０：１、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）を型に流し込み、ガラス棒を使用して過剰なＰＤＭＳを除去した。 70℃で3時間硬化させると、厚さ300μmのPDMSフィルムを金型から剥がすことができます。

多機能塗布、オンデマンドリリース、堅牢な動作の写真はすべて高速カメラ (Sony AX700、1000fps) を使用して撮影されました。 ロバスト性テストに使用したオービタルシェーカーは SCILOGEX から購入しました (SCI-O180)。 空気圧の生成にはエアコンプレッサーが使用され、圧力値の調整にはいくつかのデジタル精密圧力調整器が使用されました。 フロー動作テストのプロセスは次のとおりです。 所定量の液体が試験装置に注入され、高速カメラが流れの挙動を記録しました。 次に、固定時点での流れ挙動ビデオから静止画像をキャプチャし、ソフトウェア Image-Pro Plus を使用して残りの面積を計算し、チャンバーの深さを乗算して体積を計算しました。 流れ挙動試験システムの詳細は、補足図S4にあります。

50μlのマイクロビーズおよび100μlのDI水を気泡混合装置に注入した。 混合パフォーマンスの写真は、圧力をそれぞれ 0.1 bar、0.15 bar、0.2 bar に変化させて、高速カメラで 0.1 秒ごとに撮影されました。 これらの写真から、写真加工ソフト（photoshop CS6）を使用して、ミキシング時のピクセル情報を取得できます。 そして、混合効率は次の式53を使用して達成できます。

ここで、M は混合効率、N はサンプル ピクセル ポイントの総数、ci と \(\bar{c}\) は正規化された濃度と期待される正規化された濃度です。 混合効率の範囲は 0 (0%、混合なし) ～ 1 (100%、完全混合) です。 結果を補足図S6に示します。

IAV および IBV リアルタイム RT-PCR キットには、IAV および IBV RNA サンプル (カタログ番号: RR-0051-02/RR-0052-02、Liferiver、中国)、Tris-EDTA バッファー (TE バッファー、カタログ番号: B541019、Sangon Biotech、中国）、RNA 精製キット（カタログ番号：Z-ME-0010、Liferiver、中国）、およびポジティブコントロール用の GAPDH 溶液（カタログ番号：M591101、Sangon Biotech、中国）はすべて市販されています。 RNA精製キットには、結合緩衝液、洗浄A、洗浄W、溶出液、磁性マイクロビーズ、アクリルキャリアが含まれています。 IAV および IBV リアルタイム RT-PCR キットには、IFVA 核酸蛍光 PCR 検査混合物と RT-PCR 酵素が含まれています。 6μlのアクリルキャリアおよび20μlの磁性マイクロビーズを500μlの結合緩衝液に添加し、これを振盪し、続いてマイクロビーズ溶液を得た。 洗浄液Ａ、Ｗにエタノール２１ｍｌを加えて振とうし、それぞれ洗浄液Ａ、洗浄液を得た。 次いで、18μlのIFVA核酸蛍光PCR試験混合物および1μlのRT-PCR酵素を1μlのTE溶液に添加し、これを数秒間振盪および遠心分離し、こうしてIAVおよびIBVの両方に対する20μlのプライマーを生成した。

以下の RNA 精製プロセスに従いました: (1) RNA の吸着。 526μlのマイクロビーズ溶液を1.5mlの遠心分離管にピペットで移し、これに150μlのサンプルを加えた。 次に、チューブを手動で 10 回上下に振りました。 混合物 676 μl をアフィニティーカラムに移し、回転速度 1.88 × 104 g で 60 秒間遠心分離しました。 その後の廃液は廃棄した。 (2) 洗浄ステップ 1。 500μlの洗浄溶液Aをアフィニティーカラムに加えた。 遠心分離は 1.88 × 104 g の回転速度で 40 秒間行われ、その後廃液は廃棄されました。 この洗浄工程を２回繰り返した。 (3) 洗浄ステップ 2。 アフィニティーカラムに洗浄液 W 500 μl を加え、回転数 1.88 × 104 g で 15 秒間遠心分離し、廃液を廃棄した。 この洗浄工程を２回繰り返した。 (4) 溶出。 200 μl の溶出液をアフィニティーカラムに加え、1.88 × 104 g の回転数で 2 分間遠心分離しました。 (5) RT-PCR: 溶出液を PCR チューブ内の 20 μl プライマー溶液に導入しました。 次にチューブをリアルタイム PCR 検査装置 (SLAN-96P) に置き、RT-PCR プロセスを実行しました。 検査プロセス全体には約 140 分かかりました (RNA 精製は 20 分、PCR 検査は 120 分)。

526 μl のマイクロビーズ溶液、1000 μl の洗浄 A 溶液、1000 μl の洗浄 W 溶液、200 μl の溶出溶液、および 20 μl のプライマー溶液をあらかじめ添加し、チャンバー M、W1、W2、E、および PCR テストチャンバーに保管しました。プラットフォームが組み立てられます。 次に、150μlのサンプルをピペットでチャンバーMに移し、FAST-POCTプラットフォームを補足図S9に示す検査機器に挿入しました。 約 82 分後、テスト結果が得られました。

すべての試験結果は、特に指定がない限り、生物学的に独立したサンプルを使用して別の FAST-POCT プラットフォームを使用して少なくとも 6 回繰り返した後の平均値 ± SD として表示されます。 分析から除外されたデータはありません。 実験はランダム化されていませんでした。 研究者は、実験中にグループの割り当てについて知らされていませんでした。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究の結果を裏付けるデータは補足情報から入手できます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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CLとHJは、サンプル収集と独立した検証に対するVantronics LLC、浙江大学第一付属病院（浙江省杭州）のJun Fan博士からの支援に感謝します。 実験研究の一部は、CL と HJ がアリゾナ州立大学に在籍していたときに、同大学の施設を使用して実施されました。 HJ はウェストレイク大学からの支援に感謝します。

西湖大学工学部、杭州、310024、中国

チャオ・リャン＆ハンチン・ジャン

Vantronics Hangzhou Intelligence Technology Ltd.、杭州、311100、中国

ヤン・ジハン

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CL と HJ は実験を計画しました。 CLとZYは実験と解析を実施した。 CL と HJ は理論分析を行い、論文を執筆しました。

江漢清氏への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

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転載と許可

Liang, C.、Yang, Z. & Jiang, H. 液体の多機能、オンデマンド、堅牢な操作のためのフィルムレバー作動スイッチ技術。 Nat Commun 13、4902 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-32676-4

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受信日: 2021 年 12 月 13 日

受理日: 2022 年 8 月 11 日

公開日: 2022 年 8 月 20 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32676-4

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