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Mar 29, 2023

刺胞動物の刺咬小器官の構造と作動機構

Volume sulle comunicazioni sulla natura

Nature Communications volume 13、記事番号: 3494 (2022) この記事を引用

5264 アクセス

6 引用

460オルトメトリック

メトリクスの詳細

クラゲ、イソギンチャク、および他の刺胞動物の刺胞細胞（刺胞）として知られる刺胞小器官は、捕食と防御の両方に使用される注目すべき細胞兵器です。 刺胞は、コイル状の銛のような糸が入った加圧カプセルで構成されています。 これらの構造は、刺細胞として知られる特殊な細胞内に構築されます。 トリガーされると、カプセルが爆発的に放電し、コイル状の糸が放出され、ターゲットに穴を開け、外反と呼ばれるプロセスで裏返ることによって急速に伸びます。 糸の構造が複雑で、放出速度が非常に速いため、刺胞発火の正確な仕組みは依然として解明されていません7。 ここでは、ライブおよび超解像度イメージング、3D 電子顕微鏡、および遺伝的摂動を組み合わせて、モデルイソギンチャク Nematostella vectensis における刺胞操作の段階的なシーケンスを定義します。 この分析により、自然界で最も精巧な生物学的マイクロマシンの 1 つである刺胞の作動機構を支える複雑な生体力学的な変化が明らかになりました。 さらに、この研究は、関連する刺胞動物の細胞小器官の形態と機能についての洞察を提供し、生物からインスピレーションを得たマイクロデバイスの設計のテンプレートとして機能するでしょう。

刺胞動物の刺胞細胞は、高度に特殊化された形態と機能を備えた複雑な細胞内兵器です1,2。 刺胞は、加圧カプセル内に封入された毒糸で構成されるゴルジ由来の細胞内小器官です 3,4。 トリガーされると、カプセルが放電し、その糸を銛のように射出し、標的を貫通し、神経毒のカクテルを送り出します5、6、7、8、9、10。 細胞レベルでは、刺胞の排出は自然界で最も速い機械的プロセスの 1 つであり、ヒドラ刺胞では 3 ミリ秒以内に完了することが知られています 11,12。 ヒドラ狭窄症の高速ビデオで行われた測定により、圧力によるカプセルの爆発とその後の糸の放出の初期段階が 700 ナノ秒という速さで発生することが明らかになりました 12。 この爆発的放出の初期段階は、真菌の胞子の放出、花粉の放出、渦鞭毛藻の弾道小器官の放出など、自然界で見られる他の超高速発射システムに匹敵します。

これまでの研究では、刺胞の高速放出は、カチオン結合ポリ-γ-グルタミン酸ポリマー（PG）のマトリックスによるカプセル内の浸透圧の蓄積と、強力なバネによってエネルギーを放出する弾性的に伸ばされたカプセル壁によって引き起こされることが示されています。放電時の同様のメカニズム2,12,15,16。 トリガー後、放出前に、水の急速な流入により、カプセルの体積は約 2 倍になります 17。 これにより、マトリックスが浸透圧で膨張し、カプセル壁が引き伸ばされます 2,18。 このエネルギーはその後、糸を高速で射出するために利用され、標的組織に衝撃を与えて貫通します。 刺胞排出の後期段階には糸の伸長が含まれますが、これはより遅い時間スケールで進行し、ミリ秒以内に完了します 11。 この段階では、刺胞の糸は形状変形を受け、浸透圧で発生した圧力と糸に蓄えられた弾性エネルギーの両方の解放によって引き起こされる外反と呼ばれるプロセスを通じて裏返しになります17、19、20。 したがって、刺胞は、標的を突き刺す初期段階と内腔を形成する外反の後の段階を含む、異なる段階で動作します。

刺胞動物の種によって刺胞の特徴は著しく異なり、莢膜のサイズや糸の形態に多様性を示しますが、いずれも爆発的な噴出によって駆動される可逆尿細管を含む同様の動作機構を保持しています 2,21,22,23。 遺伝的に扱いやすいシステムにおける刺胞の生物学を調査するために、ここではイソギンチャク Nematostella vectensis の刺胞糸の働きを調査します。 Nematostella は 2 種類の刺胞を保有しています。微生物の p-マスチゴフォアと基底性イソリザで、後者には短い品種と長い品種があります 24,25。 イソギンチャクでは、刺胞嚢は刺糸に接続された 3 つの頂端のフラップによって密閉されています 26、27、28。 この糸は、短くて硬い繊維状のシャフトと、とげで装飾された長くて細い細管という 2 つの異なる部分構造で構成されています 17,22。 シャフトは 3 本のらせん状に巻かれたフィラメントで構成されており、最初は圧縮された発射体として射出されてターゲットを貫通し、その後反転して内腔を形成し、そこから糸の残りの部分である細管が放出されます 17。 シャフトの反転には、きつく圧縮されたコイルから中空の注射器への幾何学的変形が伴うことが知られていますが、このプロセスを駆動するメカニズムはほとんど理解されていません。 さらに、細管の外反は、らせん状フィラメントが存在しない場合、細管が裏返ることによって外転するため、三重螺旋シャフトの外転とは大きく異なります 26,29。 カプセルに蓄えられた圧力と弾性エネルギーの解放は、理論的にはシャフトの最初の射出と貫通を駆動するのに十分ですが、糸をさらに伸ばすには追加のエネルギー源が必要になる可能性があります5、19、20。 これらの出来事の速度と複雑さのため、これまでのところ、退院と外反の正確な段階はわかりにくいままです。

今回我々は、線虫の刺胞放出の異なる段階における軸と細管の両方の構造組成と機械的変化を実証し、さらに刺胞糸状の部分構造の動作機構を報告する。 私たちの分析により、刺胞の作動機構を支える複雑な構造と高度な生体力学的変換が明らかになりました。

Nematostella における刺細胞 (刺胞) とその刺胞の分布を理解するために、我々はまず、ネマトガレクチン プロモーター領域の制御下で刺胞内で EGFP を発現するトランスジェニック株を作成しました (ネマトガレクチン > EGFP; 図 1a)。 ネマトガレクチンは刺胞の主要成分であり、その形態形成中に糸状構造に組み込まれます 30。 このタンパク質は、他の構造タンパク質が糸に集合するための基質として機能すると考えられているため、その一時的な発現は、刺細胞を視覚化するための有用なウィンドウを定義します 30。 トランスジェニック一次ポリープのライブイメージングにより、触手には長い形態の基底細胞を有するEGFP + 刺細胞が大量に存在していることが示されました（図1aI）。 本体の列には、いくつかの p-マスチゴフォアとともに短い品種が配置されていました。 興味深いことに、我々は、線状細胞が神経突起様のプロセスを介して接続され、局所的なネットワークを形成していることを発見した（図1aII、矢印）。 線細胞はシナプスを形成し、求心性神経またはエフェクターとして機能することが知られていますが、細胞自律的に動作することもできます 31、32、33、34。 したがって、観察されたネットワークは、線細胞集団の集団行動と協調した活動を制御する際に機能している可能性があります 35。 EGFP + 刺細胞では、蛍光は細胞質および感覚装置全体で検出されましたが、莢膜からは除外されました（図1b）。 カプセルの壁と糸の一部は、架橋によってさまざまな構造線維の構築を可能にするミニコラーゲンで構築されています36、37、38、39、40、41。 私たちはこれを利用して、おそらくミニコラーゲンとの反応を通じて、成熟中に刺胞糸に組み込まれた蛍光TRITCで生きた動物を処理することにより、カプセルの内容を視覚化しました42、43。

a ネマトガレクチンプロモーターの制御下で EGFP を発現するトランスジェニック N. vectensis の一次ポリープの刺球細胞 (緑色)。 a 触手の先端での EGFP 発現。 aII EGFP 発現は本文欄にあります。 矢印は、刺細胞を接続する細胞プロセスのネットワークを指します。 画像は、6 個のスポーンからの主なポリプの触手と体の柱を表しています。 b 刺細胞でEGFPを発現する一次ポリープの体柱上の単一の刺細胞の拡大図（緑色）。 刺胞細胞（センサー）装置、細胞体、神経突起様突起が示されています。 TRITC (マゼンタ) は、カプセル、中央に位置するシャフト、および尿細管のひだにラベルを付けます (n = 10 個の一次ポリープ本体カラム、5 回の実験)。 c 組み込まれたTRITCの蛍光シグナルに基づくN. vectensisの刺胞形態。 密に標識されたシャフト（矢印）と、圧縮されたシャフトと連続するコイル状の細管（破線の矢印）を備えた基底性イソリサス莢膜（n = 19 短い、n = 20 長い）（左および中央のパネル）。 微小塩基性 p-マスチゴフォア カプセル (n = 10) 特徴的な V 字型ノッチを持つシャフト (矢印) (右パネル、破線の矢印) 約 300 個の初代ポリープから精製された刺胞を表す画像)。 スケールバーは1μm。 d 密にコイル状のシャフトフィラメント（青）、コイル状尿細管の一部（マゼンタ）、および2つのコネクタ領域、カプセル-シャフトコネクタおよびシャフト-尿細管コネクタ（黄色）を示す刺胞の縦断面図。 頂端のフラップは部分的に開いた構造で見られます (破線のボックス)。 対応する縦断面の 3D 再構成では、嚢、中心軸 (青色)、付着した尿細管の一部 (マゼンタ)、コネクター領域 (黄色)、および頂端皮弁 (破線のボックス) が示されています。 e 刺胞の横断面。カプセル壁、密な層状シャフト、およびプロペラ状の細管が示されています。 (n = 2 つの一次ポリープ サンプルで確認できる約 350 個のカプセルからの完全な体積のカプセル画像。

基底富型刺胞では、TRITCの取り込みは糸の陥入後にのみ見られました（補足図1a、矢印）。 対照的に、成熟糸を保持する線状細胞には TRITC がありませんでした (補足図 1a、破線の矢印)。 これは、染料がカプセル内の糸の陥入部分に特異的に蓄積することを示唆しています。 ネマトガレクチン様遺伝子Nemve1_232014のshRNA媒介ノックダウンにより、異常なカプセルが生じ、糸の形成が妨げられることがわかりました（補足図1b）。 これは、レクチンが糸およびカプセルの形態形成において重要な役割を果たしていることを示唆しています（補足図1b、破線の矢印）。 さらに、ノックダウンによりqPCRによってNemve1_232014 mRNA発現が2倍減少することを確認しました。これは、糸とカプセルの適切な組み立てのためにこのタンパク質が豊富に存在する必要があることを示唆しています（補足図1c）。 次に、ネマトガレクチン>EGFPとTRITC色素標識の組み合わせを利用して、糸の発達から焼成後の最終形態までの糸の構造を分析しました（図1b、c;補足ムービー1）。 色素強度が尿細管に比べて非常に高かったp-マスチゴフォアの高密度シャフト（図1c、矢印）とは対照的に、蛍光TRITCは、バシトリチのシャフトと尿細管の両方に同様の強度で取り込まれました（図1c、矢印）。破線の矢印）。 バシリッチのより均一な標識と一次ポリープにおけるそれらの蔓延により、この刺胞タイプにおける糸の動作を調査することになりました。

シャフトと細管の構造を分析し、それによってそれらの機能を決定するために、次に、走査型電子顕微鏡を使用して連続切片から未放出のベイスリッチカプセルの3D再構成を実行しました（SEM;図1d;補足ムービー2）。 圧縮されたシャフトは、頂端フラップによって形成されたカプセル開口部に垂直に整列した、しっかりとコイル状に巻かれたフィラメントで構成されていることがわかりました（図1d、ボックス）。 フィラメントは、電子密度の高い層と電子透過性の層から構築されたラメラのスタックを備えた複合構造でした。 これらの結果は、Godknecht と Tardent (1988) によって Anemonia sulcata で観察されたものと同様の三重項ラメラ構造を裏付けており、彼らは、シャフトの先端がカプセルの開口部に向かう小さな領域に収束する千鳥状のラメラによって形成されていると指摘しました 17。

我々のSEMデータを綿密に検査したところ、シャフトフィラメントを包む糸壁が緩いカプセルとシャフトのコネクタで頂端フラップに接続されていることがさらに明らかになりました。 同様のシャフトと尿細管のコネクターが、シャフトの基端と尿細管の先端との間に配置されました。 尿細管はねじれ、規則的な縦方向の部分にひだを形成しました (補足ムービー 2、3)。 カプセルの断面では、シャフトラメラがしっかりとコイル状に巻かれて圧縮されていることが観察され、一方、細管の断面はプロペラ状の構造を示しました（図1e;補足ムービー4）。

糸の動作の明確な段階を決定するために、次に、TRITC 標識動物の放電イベントの蛍光高速ムービーを記録しました（補足ムービー 5-7）。 in situ の刺細胞刺激後、圧縮されたシャフトは最初に高密度の発射体として放出され、その後急速に拡張して細長い円筒を形成し、そこから細管が出現しました（図 2aII-aIV、矢印、補足ムービー 5）。 これらの観察に基づいて、我々は刺胞操作の 3 つの主要な段階、すなわちシャフト排出 (フェーズ I)、シャフト外反 (フェーズ II)、および尿細管外転 (フェーズ III; 図 2、ボックス) を定義しました。 SEMを用いて吐出軸の微細構造を可視化しました。 非放電状態では、シャフトがカプセルシャフトコネクタに向けて先細になっている領域を装飾するまばらなラメラが観察されました（図2b、破線の矢印）。 放電の初期段階では、反転したカプセルとシャフトのコネクタがトラバースシャフトの周囲にスカートを形成し、二重壁構造（図2c、矢印）を形成し、反転していないシャフトがコネクタ内で前方に移動しました（図2c、青色）。 。 裏返されたカプセル-シャフトコネクタは、非放電状態で観察されたラメラの裏返しに由来する不規則な棘に似たまばらなフィラメントで外側を覆われていました（図2c、破線の矢印）。 連続 SEM 切片では、裏返されたコネクタ (図 2d、矢印) も捕らえられ、その中で尿細管がカプセルから離れるのが観察できました (図 2d、破線の矢印、補足ムービー 8)。 最後に、部分的に排出された刺胞細胞の糸の SEM 切片では、中空のとげで外側が装飾されている、裏返された部分の内側を横切る非裏返しの細管を観察しました（図 2e、矢印、補足ムービー 9）。

a 刺胞排出のライブイメージング。 TRITC 標識刺胞を in vivo で排出し、5 ミリ秒間隔でフレームをキャプチャしました。 aI – aIV シャフトの分泌と尿細管の伸長に対応する異なる段階を示すスナップショット。 注: シャフトの外反 (フェーズ II) は速すぎて、このシーケンスでは捉えることができませんでした。 b 放出前のカプセルの縦断面図（C）。反転されていないシャフト（US）と、シャフトと尿細管の接続部（黄色、矢印）へのそのテーパー（破線の矢印）、頂端フラップ（V 字型）、および反転されていないシャフトを示しています。尿細管（マゼンタ）。 c シャフト反転中の放出されたカプセルの縦断面図。 反転していないシャフトフィラメント（US、青色）、カプセル-シャフトコネクター（カプセルの外側、黄色）、細管の一部（マゼンタ）、およびシャフト-尿細管コネクター（黄色）。二重壁構造（矢印）およびまばらコネクタの外側のラメラ (破線の矢印) が示されています。 d 裏返されたシャフトカプセルコネクターの縦断面図（黄色、矢印）および横向きの非裏返し尿細管（UT、マゼンタ、点線の矢印）。 e 部分的に裏返した尿細管の縦断面図。 裏返されたシャフト（ES、青、矢印）、カプセルシャフトコネクター（黄色、破線の矢印）、裏返された尿細管（ET）内の非反転尿細管の一部（UT、マゼンタ）、およびバーブ（B）が示されています。 f TRITC の取り込みによって明らかになった部分的に反転した刺胞細胞の糸。反転したシャフト (ES) フィラメント、反転していない尿細管 (UT、中央)、および尿細管 (ET) の反転部分を装飾するバーブ (B) が示されています。 対応する EM 断面: fI 尿細管の断面。 ラベルは、中心に位置するバーブ (B) を備えた裏返された尿細管セグメントと反転されていない尿細管セグメントを示します。 fII 部分的に裏返された尿細管の斜断面図。外側の尿細管セグメントと返しが示されています (B)。 fIII 反転したシャフト（ES）と横切る非反転尿細管（UT）の断面図。 ES フィラメントの電子密度の高い層と透明な層 (矢印) が示されています。 g 部分的に排出された刺胞を、蛍光色素結合小麦胚芽凝集素 (WGA、マゼンタ) および TRITC (緑色) で染色しました。 拡大領域: gI シャフトと尿細管の接続部 (矢印) と返しの付いた反転尿細管 (破線の矢印)。 gII シャフト フィラメント (緑色、矢印) と WGA ラベル付きのねじ壁 (マゼンタ)。 gIII ネジ壁 (WGA、マゼンタ) と横切る非反転尿細管 (TRITC、緑色、点線の矢印) を示すカプセル-シャフト コネクタ (矢印)。 h 糸の反転の異なる段階の代表的な画像。 蛍光染色は各段階の幾何学的変化を示します。 矢印は、個別のフェーズ中のねじ山の頂点を示します。

上記の構造変化をよりよく理解するために、次に、外反が起こっている TRITC ラベル付きスレッドの超解像度画像を分析しました。 このアプローチにより、とげの標識によって追跡できる、横切る非反転小管とともに、巻き戻されていないシャフトフィラメントの三重らせん幾何学的形状の存在を実証することができました（図2f）。 興味深いことに、糸壁にはTRITCが組み込まれておらず、蛍光画像では見えませんでしたが、対応するSEM断面では、圧縮状態の非反転尿細管を囲む電子透過層として見ることができました（図2fI、fII）。 反転していない尿細管内のとげの高度に規則的な配置は、これらの構造が柱として積み重ねられていることを示しており、蛍光画像では単一のフィラメントとして見えます（図2f、fI）。 さらに、シャフトのSEM断面は、蛍光画像で見られるように、そのフィラメントが横切る非反転細管を囲むラメラから構成されていることを示しました（図2f、fIII、矢印）。

光学画像では見えなかった糸の壁を視覚化するために、次に糸の他の構成要素に注目しました。 ミニコラーゲンとともに、ヒドラとネマトステラの刺胞はグリカンを含み、組成において細胞外マトリックスとの類似性を示します44、45、46、47、48。 刺胞特異的レクチンであるネマトガレクチンは、主に非硫酸化コンドロイチン鞘からなるグリカンにミニコラーゲンを結合する足場として機能します 30,46,49。 構造中のレクチンの存在を考慮して、蛍光標識された糖結合レクチンを使用して GAG の存在を検出できるという仮説を立てました。 したがって、GlcNAc鎖に選択的な蛍光色素結合小麦胚芽凝集素（WGA）で排出された刺胞を染色し、WGAが電子透過性の糸壁に強く結合していることを発見しました（図2g）50。 WGA および TRITC との共染色により、WGA 染色材料が TRITC と共局在せず、むしろ TRITC 標識構造と積層体を形成することが示されました。 最後に、初期の裏返された状態の糸の画像は、TRITC 標識シャフトが WGA 標識尿細管壁を取り囲んでいることを示しました。 TRITCで不十分に標識されたフィラメントまたはバーブを欠くコネクタ領域は、蛍光WGAでより強く標識されました（図2gI-gIII）。

重要なことに、TRITC標識が透過照明チャネルのシャフトフィラメントと重なっていることが観察され、シャフトファイバーがTRITC標識物質を保持していることを示唆しています（補足図2a、矢印）。 対照的に、蛍光 WGA 標識は壁構造を取り囲む内部に豊富にありました。 WGA 層は TRITC 標識領域と繰り返しのラメラを形成しましたが、TRITC 標識材料とは重なりませんでした（補足図 2b、c、TRITC、矢印、WGA、破線の矢印）。 TRITCおよびWGA標識とミニコラーゲンNcol4の抗体染色を組み合わせることで、成熟カプセルの糸が陥入している部分のみにTRITCシグナルが存在することが判明した。 TRITCは、Zenkertらによって報告されているように、ネマトステラ・ミニコラーゲンNcol4で染色できる成熟莢膜を標識しなかった。 (2010)24,25. 触手の先端では、外胚葉の奥深くで発達中のカプセルはNcol4抗体で染色されましたが、触手上皮の表面を裏打ちする完全に成熟したカプセルは染色されませんでした（補足図3、4、矢印）。 結論として、これらの結果は、ねじ山が 2 つの層で構成されていることを示唆しています。1 つは TRITC 検出可能なシャフトのフィラメントとバーブを形成する TRITC 標識層、もう 1 つはコネクター領域、シャフト壁、そして尿細管壁。

ゲル基質を貫通する刺胞細胞の糸の構造研究は、シャフトの反転がシャフトの頂点で開始されることを示しています 17。 シャフトが圧縮状態から緩い三重らせん構造にどのように変化するかを調べるために、我々は、ネマトステラの一次ポリープを、同時に放電を引き起こし、サンプルを迅速に固定する溶液で処理することにより、放電の初期段階を捕捉した24。 静止画像から再構成された一連のイベントにより、シャフトがコイル状の構成でカプセルから出るときのシャフトの複雑な幾何学的変形が明らかになりました（図2hおよび補足図5a、矢印）。 我々は、シャフトの排出中（フェーズ I）、排出されたシャフトがカプセルシャフト コネクタ内で高密度の発射体として、コネクタが最大長さまで伸びるまで前方に移動し続けることを発見しました。 シャフトの外反（フェーズII）中、フィラメントはシャフトの頂点から巻き戻り始め、裏返しになり、それによって裏返されますが、シャフトの基端は、解けるフィラメントの内側で前方に移動しました（補足図5b）。 シャフトの裏返った先端は槍の穂先のような構造を示しました（補足図5c、矢印）。 細管は、シャフト-細管コネクターを介してシャフトの基端に取り付けられ、したがって、コイル状になっていないシャフトフィラメントの内側に新たに形成された内腔を通して引っ張られました。 この動きにより 3 本のフィラメントが完全に外反し、シャフトの元の先端が基端になりました。 最後に、裏返されたシャフト内腔が開き、シャフトと尿細管のコネクターの移動が可能になり、フェーズ III が開始されます。 反転した尿細管の外側にとげが出現すると、シャフトと尿細管の接続部と尿細管自体との境界が画定され、尿細管の反転の始まりが示されました（図2gI;図2h、最後のパネル。補足図5a、最後のパネル）。 ）。 まとめると、これらのデータは、シャフトの外反が、フィラメントの巻き戻しと前進運動を含む再現可能な一連の物理的変形を実行することを示しています。

SEM画像と蛍光画像により、三重らせん線維性シャフトと滑らかな円筒状細管の組成と構造の違いが明らかになりました（図3a、b）。 シャフトの反転は 3 本のフィラメントの動きによって説明できますが、尿細管にはそのような幾何学的形状が欠けており、尿細管壁の展開とねじれの解除を含む機構によって反転する可能性があります 19,29。 ライブイメージングにより、尿細管の伸長中に、前方に移動する尿細管のねじれが解けて円筒状態に弛緩したことが明らかになりました（図2aIII-aIV、図3b、ステージ1、2、補足ムービー5）。 反転先端では、返しポケットに沿った WGA 染色の集中により、反転小管セグメントの螺旋状のねじれが見られました (図 3c)。 対照的に、尿細管の外反開始直後に撮影された画像では、尿細管は裏返されていない壁と裏返された壁の間に内腔を備えた二重壁の円筒構造として見られ、尿細管が急速に弛緩してねじれが解けた可能性が高いことを示唆しています（図3d、矢印） ）。 これらの結果は、尿細管の反転はプロペラ状の形状から円筒形の構造へのねじれを解く段階を経て起こる可能性が高く、反転した部分のねじれを戻して弛緩する作用により、残りの反転されていない尿細管が遠位先端まで送り込まれることを示している。

シャフト（矢印）、細管、およびらせん状に配置されたバーブ（破線の矢印）のSEM画像（n = 6、2回の実験）。 b 部分的に反転した尿細管の蛍光画像。 シャフトのフィラメントとバーブ (TRITC、緑色) および糸壁 (WGA、マゼンタ) が示されています (n = 10 個の一次ポリプ触手、3 回の実験)。 スケールバーは2μm。 c 反転尿細管先端の超解像度画像（ステージ 1）（一次ポリープ触手の n = 20 スレッド）。 バーブ（TRITC、緑色）、尿細管（WGA、マゼンタ）、結合チャネルが示されています。 スケールバーは0.5μm。 d 反転尿細管の先端（ステージ 2）（一次ポリープ触手の n = 8/30 の二重壁糸）。 尿細管壁（マゼンタ）、その二重壁構造（左中央パネル、矢印）、および棘（右中央パネル、矢印）が示されている。 ステージ 2 の図 (右パネル)。 スケールバーは1μm。 e スクランブル コントロール (一次ポリープ触手の n = 0/20 部分的に放出された糸) および v1g243188 (一次ポリープ触手の n = 20/20 部分的に放出された糸) shRNA KD サンプル (破線の矢印) における尿細管バーブの構造 (矢印) ）。 v1g243188 スレッドを視覚化するために明るさが調整されました。 スケールバーは2μm。 f バーブ (TRITC、緑色) および尿細管壁 (WGA、マゼンタ) に対するスクランブルと v1g243188 ノックダウンの影響。 矢印は、乱れた棘を示します (スクランブル (n = 0/25 スレッド) と比較した n = 25/25 スレッド。v1g243188 スレッドを視覚化するために明るさを調整しました。一次ポリープ触手から部分的に放出された糸の代表 (スクランブル、n = 27 一次スレッド)ポリープ触手; v1g243188、n = 25 一次ポリープ触手、n = 5 shRNA ノックダウン実験). スケール バー 1 μm. g TRITC および WGA で標識された完全に反転した糸 (n = 15 の精製および放出された糸). 矢印は、ねじれを示します。遠位尿細管部位 gI カプセル-シャフト コネクター (矢印) および裏返されたシャフト (緑色、破線の矢印) gII シャフト-尿細管コネクター (矢印) および裏返されたシャフト (破線の矢印) gIII 完全に裏返された尿細管壁 (マゼンタ) gIV とげ（緑、矢印）でまばらに装飾された細管壁（マゼンタ、破線の矢印）を示す糸の先端。

ヒドラ スピナリンは、ヒドラ刺胞細胞の軸の表面にあるスパイン構造に存在するグリシンとヒスチジンが豊富なタンパク質です 51,52。 Nematostella の細管反転における中央に積み重ねられた棘の役割をテストするために、我々は shRNA53,54 を使用して、スピナリン様産物をコードする線虫細胞特異的遺伝子であると以前に報告されている v1g243188 をノックダウンしました 55。 しかし、さらなる分析により、v1g243188 は配列組成においてヒドラ スピナリンとはかなり離れたフィブロイン様因子をコードしていることが示唆され 51,52、ヒドラ スピナリンの直接のオルソログはネマトステラでは同定されなかった 49。 それにもかかわらず、我々は、v1g243188 のノックダウンにより、弱く標識されたより細いシャフトフィラメントが生じ、場合によってはとげの構造が目に見えて破壊されることを発見した。 TRITC強度の損失は、v1g243188の存在により直接的または間接的に色素の一部もシャフト構造に組み込まれたことを示した。 ノックダウンによりバーブの構造とその配置が破壊されましたが（図3e、矢印）、これはネジの動作には影響を与えないようでした。 しかし、v1g243188の損失により、対照と比較して尿細管の曲がりが増加しました（図3e、破線の矢印）。 この観察は、v1g243188 がスレッドのコンポーネントであり、その構造の完全性には役割を果たすが、その動作には役割を果たさないことを示唆しています。 さらに、我々は、最も強い表現型を示すサンプルでは、​​とげの典型的な螺旋配置とその積み重ね構成が破壊されたことに注目した（図3f、矢印、補足図6a、ボックス）。 放出された糸のシャフト構造のTRITC強度の測定は、v1g243188ノックダウン後にTRITCの取り込みが減少し、mRNAレベルが約65％減少したことを示しました（補足図6d、e）。 排出された刺胞では、完全に反転した糸は、コネクタ領域を除いて、TRITC標識バーブおよびシャフトフィラメントを備えたWGA標識壁で構成される等径管であるように見えました（図3g、破線ボックス）。 トゲの密度は尿細管の近位端から遠位端に向かって減少し、遠位領域はまばらに装飾されていました（図3gII-gIV）。 我々は、外反前に内部で積み重ねられ、外反後に外部でらせん状に分布したとげが、伸長する尿細管のさらなる曲がりやよじれを防ぐ骨格として機能するのではないかと仮説を立てています。 実際、とげが遠位に向かって減少するにつれて、細管は滑らかな曲線で曲がることができる近位領域と比較してよじれやすくなっているように見えました（図3g、矢印）。 興味深いことに、伸長する糸のライブイメージングでは、細管がとげの密な近位領域で滑らかな180°回転を実行することが観察されました（補足ムービー10）。 まとめると、我々のデータは、尿細管の外反には尿細管壁の展開が関与しており、その中でかえしが伸長する糸を構造的に支持している可能性が高いことを示しています。

これらの発見により、観察された幾何学的反転の重要な側面を 3 つの段階で説明するモデルを構築することができました。 我々の結果は、シャフトフィラメントがカプセルフラップに頂端で付着し、コネクタ領域を介して基底で尿細管に付着していることを示唆しています（図4a）。 フェーズ I: 排出の際、排出シャフトを覆うカプセルシャフトコネクターとともにシャフトが排出されます。 二重壁構造が形成されます (図 4b、c)。 静止画像と動画に基づくと、シャフトの外転はシャフトが完全に排出された後に発生します。 したがって、排出されたシャフトがカプセルからの最大距離に達したときに、コネクタは最大の弾性応力を蓄積すると仮定します（図4c）。 フェーズ II: カプセルとシャフトのコネクタにかかる弾性応力により、圧縮されたシャフト フィラメントの頂点に外向きの力が加えられ、その結果、シャフト内の弾性応力が解放されることでフィラメントが剥離し、外反プロセスが開始されます (図 4d-)。 g、開始）。 このシーケンスが完了すると、太いフィラメントによって保護された内腔がシャフト内に形成されます（図 4h、フェーズ II の終わり）。 フェーズ III：最終フェーズは、軸と細管のコネクタを解放することから始まり、それ自体が折りたたまれて裏返って二重壁構造を形成します（図 4i）。 その後、細管の反転されていない部分が徐々にカプセルから出て、伸長している糸の反転部分を通って移動します（図4j）。

ボックスは刺胞の部分構造を示します。 下のパネル: 個別のフェーズ中の重要な領域の拡大図。 a シャフト壁に囲まれたしっかりとコイル状のシャフトを備えた未排出のカプセル、2 つのコネクタ、およびコイル状の細管。 b、c シャフト排出の初期段階（フェーズ I）。 射出されたシャフト フィラメントを囲むカプセル シャフト (CS) コネクタの前方への移動と反転が示されています。 矢印はシャフトの前方への動きを示します。 d–h シャフトの幾何学的な外反メカニズムと圧縮されたシャフト フィラメントの巻き戻し（フェーズ II）。 矢印は、圧縮されたシャフト フィラメントの頂点に加えられる力の方向を示します。 e–g シャフトの外反の進行の段階。 このモデルは、ほどけるシャフト フィラメントと、シャフトと尿細管の接続部と尿細管の前方への動きを示しています。 h シャフト外反の最終段階。 注: 裏返されていないシャフトの基端は、裏返されたシャフトの先端になります。 i–j シャフトと尿細管のコネクターと尿細管の外転機構 (フェーズ 3)。

この記事では、刺胞の 3D 構成と、その活性化時に起こる一連の幾何学的変化について説明しました。 また、スレッドの反転の具体的なメカニズムを説明するモデルも提案します。 我々の結果に基づいて、刺胞の作動は軸の複雑な変形と細管の伸長を含む3段階で起こり、その間に構造全体に蓄えられたエネルギーが運動エネルギーに変換されると結論付けています。 シャフトは 2 つの重要な機能を実行します。1 つは圧縮された注射器としてターゲットのキューティクルに浸透します。 2つ目は細い尿細管を通過させるための保護トンネルとしてです。

花虫類の刺胞の軸の構造は、矢じり状に並んで配置された探り針を示す特殊なヒドラの細管とは異なる、千鳥状の層状構造を示します。 Godknecht と Tardent は以前、Anemonia Sulcata の刺胞細胞の軸に見られるラメラの千鳥状の配置により、外反時にターゲットの狭い領域に「ハンマードリルのような」衝撃が生じることを示唆しました 17。 Hydra stenoteles では、スタイレットの先端が 1 点でターゲットに衝突して貫通します 2、3、11。 したがって、ヒドラの狭窄細胞における放電の動力学は、線虫の刺胞で観察されたゆっくりとした軸外転のプロセスよりも桁違いに速い11,12。

シャフトの反転プロセスは、発射体を含むパッドに取り付けられた 2 つのバンドに弾性エネルギーが蓄えられる Y 字型スリングショットの機構に似ています。 パッドを解放すると、伸ばされたバンドは幾何学的に外反します。 バンドに蓄えられた弾性エネルギーは、加速する発射体の運動エネルギーに変換されます。 刺胞も同様のアプローチを利用しますが、カプセル内の空間が限られているため、3本のフィラメントを曲げたりねじったりしてカプセルと尿細管に付着させることによって、シャフトの反転に必要な弾性エネルギーを蓄えます。 裏返されたフィラメントのらせんは、裏返されていない構成と比較して、より大きな半径と段差を示します。 したがって、螺旋コイルに蓄えられる弾性エネルギーの量は、裏返された状態では減少する。 シャフトの反転中に放出される過剰なエネルギーは、おそらくシャフトと細管の接続部の解放に使用される可能性があります（補足注1、補足図7）。 コネクタは、外転の開始時に機能する可能性があります。 カプセル-シャフトコネクタの伸長は、放電からのエネルギーを利用してシャフトの反転を開始し、シャフト-細管コネクタは「パチンコ」の弾性エネルギーを伝達して細管の反転を開始します。 ルーズなシャフトと細管のコネクターは、3 フィラメントのシャフトがねじれた細管に移行するための緩衝ゾーンとして機能する円筒形のチューブを迅速に形成します。

尿細管貫通の推進力の源は、尿細管構造に蓄積される浸透圧と弾性力によって説明できます。 破裂したカプセルの水和により、外反を起こすことなく細管が押し出され、ねじれが解けることが示されており、ねじれた細管が弾性エネルギーを蓄え、後に円筒状態への弛緩によって解放されるバネとして作用することによって運動エネルギーに変換されることを示唆している19。 、20。 弛緩時に見られる二重壁構造（図 3d、2 番目のパネル、矢印）により、カプセルから内腔への PG マトリックスの流れが可能になり、尿細管を前方に押す力が再び充電されると考えられます 20。 このプロセスは、尿細管が完全に伸びるか障害物に到達するまで繰り返されます (補足ムービー 10、11)。 要約すると、この研究は、複雑な自己組織化生物学的マイクロマシンとしての刺胞の作動能力を実証した。 私たちは、これらの古代の洗練された細胞小器官が、医療技術から材料科学に至るまでのさまざまな用途に利用できる、生物学にインスピレーションを得たマイクロスケールデバイスの理想的なモデルであると提案します。

動物は、12 千分率 (ppt) の人工海水 (ASW、海塩、インスタント オーシャン) 中で 23 °C で飼育されました。 産卵誘導とゼリー除去は前述のように実施されました58。 胚とポリープは室温 23 °C または 25 °C で培養されました。

トランスジェニックレポーター株は、線虫細胞特異的な N. vectensis ネマトガレクチンプロモーターの制御下にある EGFP を含むプラスミドのメガヌクレアーゼ媒介挿入によって生成されました 59,60。 この構築物は、ここでは分析されていないが、今後の出版物で説明される mScarlet-I ニューロン レポーターを保持するデュアル レポーター システムの一部として生成されました。

生きた Nematostella vectensis planulae (2 dpf) を、アミン反応性ローダミン誘導体 5/6-テトラメチル-ローダミン-6-イソチオシアネート、TRITC (Cayman Chemical、No. 19593) と短時間 (30 分～1 時間) 反応させました。 。 分泌物のライブイメージングのために、動物を最終濃度 1 μM で 1 時間インキュベートしました。 固定標本​​の場合、最終濃度 25 μM の TRITC を 2dpf 幼虫とともに 1 時間インキュベートします。 この研究で試験した最大 25 μM 濃度まで、蛍光色素は明らかな毒性を示すことなく動物を染色しました。 インキュベーション後、反応性色素は複数回の洗浄によって除去されました。 成熟した刺細胞が出現し、非特異的なバックグラウンド蛍光が実質的に消失するまで、動物を無色素培地の清潔な皿に移し、3 ～ 5 日間放置しました。 25 mM TRITC のストック溶液を調製し、-20 °C で冷凍保存し、化学反応性の観察可能な低下なしに使用しました。

トポグラフィーの走査型電子顕微鏡 (SEM) (図 3a) では、サンプルは以前のレポートに従って処理されました 61。 簡単に説明すると、サンプルを 2.5% グルタルアルデヒドおよび 2% パラホルムアルデヒドを含む 0.1 M NaCacodylate 緩衝液で固定し、タンニン酸水溶液、四酸化オスミウム、チオカルボドラジド、そして再び四酸化オスミウム (TOTO) で染色しました。 サンプルを段階的エタノールシリーズで脱水し、Tousimis Samdri 795 臨界点乾燥機で臨界点乾燥し、スタブに取り付け、BSE 検出器を備えた Hitachi TM4000 卓上 SEM で 15 kV で画像化しました。 内部超微細構造の電子顕微鏡 (EM) では、サンプルを上記のように固定し、1% 緩衝四酸化オスミウムで 1 時間二次固定し、0.5% 酢酸ウラニル水溶液で一括染色を 4 °C で一晩実行しました。 段階的シリーズのエタノールを、遷移溶媒としてのアセトンによる脱水および Hard Plus 樹脂 (Electron Microscopy Sciences) への浸透に使用しました。 サンプルを60℃で48時間硬化させ、ライカUC7ウルトラミクロトーム上の珪藻45度ウルトラダイヤモンドナイフまたはAT-435度ダイヤモンドナイフを使用して連続切片を50nmで切断した。 切片は、STEM イメージングの場合はスロット グリッド上に、SEM イメージングの場合は平坦な基板 (カバースリップまたはシリコン チップ) 上に収集され、70% メタノール中の 4% 酢酸ウラニルを使用して 4 分間、Sato の三重鉛染色を 5 分間使用して後染色されました。 平らな基板上の切片をスタブ上に載せ、帯電を軽減するためにカバースリップの下側を銀ペイントで塗装し、すべてを Leica ACE600 コーターで 4 nm カーボンでコーティングしました。 切片は、aSTEM または 4QBSD 検出器、SmartSEM (6.0.0、Zeiss)、および Atlas 5.2.2.15 ソフトウェア (Fibics, Inc.) を使用して Zeiss Merlin SEM で画像化されました。 連続画像は IMOD (4.9.10)62 での 3D モデリング用に位置合わせおよびトレースされ、3D モデルは Blender 2.92 (Blender Foundation) でレンダリングされました。 完全に排出された刺胞細胞の矯正（図 2e）はフィジーで行われました（ImageJ）63。 刺胞嚢全体の画像合成（図1d）と疑似着色は、Photoshop 2021（Adobe, Inc.）で行われました。

TRITC処理動物の刺胞は、酢酸を使用して培地のpHを下げることによって排出された。 刺胞は、培地が酸性になると生体内で排出されます。 一次ポリープは、シリコーンシーラントを使用してガラススライドとガラス底皿の底の間に挟むことによってガラス底皿に固定されました。 画像は氷酢酸 (37%) を ASW に滴下した後に撮影されました。ASW は培地中の pH が特定の閾値以下に十分に低下したときにカプセルの放出を引き起こします。 刺胞の成熟と排出イベントのライブ イメージングは​​、100 倍の対物レンズを備えた Nikon Ti2 プラットフォーム上の横河 CSU-w1 スピニング ディスク システムを使用して記録されました。

TRITC 処理した一次ポリープをラブドフスキー固定液 (エタノール:ホルムアルデヒド:酢酸:dH2O; 50:10:4:36) で一晩固定しました 24。 固定液を除去し、サンプルを1 mlのPBS pH 7.4で5回洗浄して固定液を除去した。 サンプルは、PBS、pH 7.4中の0.1% Triton-X100で15分間透過処理されました。 PBST (0.1% Tween 20 を含む PBS、pH 7.4) でさらに数回洗浄した後、まずポリープを 1 時間ブロックし、10% ヤギを添加した PBST 中の NvNCol-4 (1:500) とともに 4 °C で一晩インキュベートしました。血清。 ミニコラーゲンおよび Ncol424 Nematostella vectensis ミニコラーゲン NvNcol-4 タンパク質に対して産生された抗 NvNcol-4 抗体 (ウサギ、希釈 1:500) は、ハイデルベルク大学の Suat Ozbek からの親切な贈り物でした)。 ポリープを 10% ヤギ血清を添加した PBST で 3 回洗浄し、Alexa Fluor 647 結合抗ウサギ二次抗体 (ヤギ抗ウサギ IgG (H + L)、希釈 1:500、Thermo Fisher、カタログ番号: A21245、ロット: 1981173) および WGA-OregonGreen (希釈 1:500、Invitrogen カタログ番号: W7024B、ロット: 2298084) を 10% ヤギ血清を添加した PBST 中で一晩処理しました。 その後、ポリープをＰＢＳ中で数回洗浄し、９０％ＰＢＳ／グリセロール中で一晩インキュベートした。 ポリープをスライドガラスに移し、ProLong Glass 退色防止封入剤 (ThermoFisher、カタログ番号: P36982) を使用してスライドガラス上にマウントしました。 蛍光画像は、Nikon Ti2 プラットフォーム上の横河 CSU-w1 を使用して取得されました。 超解像度蛍光共焦点画像は、Zeiss LSM780 の Airyscan モードを使用して取得されました。

図2fでは、TRITC処理した一次ポリープをラブドフスキー固定液（エタノール：ホルムアルデヒド：酢酸：dH2O; 50：10：4：36）で一晩固定しました24,25。 数回洗浄した後、ポリープをPBS/グリセロール(PBS)に移し、一晩インキュベートした。 ポリープをスライドガラスに移し、ProLong Glass Antifade Mountant (ThermoFisher、カタログ番号: P36982) でマウントしました。 ポリープをスライドガラス上に広げた。 部分的に放出された刺胞を有する標識された触手を、無傷であるか、または組織からカプセルを剥がすためにカバースライドで押しつぶされて画像化された。 蛍光イメージングは​​、Zeiss LSM780 を Airyscan モードで使用して実行されました。

TRITC処理した一次ポリープを液体窒素中で凍結し、解凍し、プラスチック乳棒を用いて手動で浸軟化した。 サンプルは、微量遠心分離管への付着を防ぐために、0.01% Tween20を補充した300 mM スクロース中の1 ml Percoll (50%、v/v; Sigma Cat. #: P1644) に懸濁しました。 組織はピペッティングにより上下にさらに破壊されます。 混合物を氷上に３０分間放置し、９５０ｇで１５分間遠心分離する。 ペレットを０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで２回洗浄し、刺胞排出緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＣａＣｌ２）に再懸濁する。 1 mM DTT を添加することで放電を開始し、30 分間インキュベートしました。 30分間インキュベートした後、OregonGreenと結合した1μg/ml小麦胚芽凝集素(希釈1:500、Invitrogen、カタログ番号W7024B、ロット:2298084)をチューブに添加し、1時間インキュベートした。 染色されたサンプルを PBST で 2 回洗浄し、1000 × g で 5 分間遠心分離しました。 ゆるいペレットが見られ、PBST に懸濁されています。5 μl アリコートをスライドガラス上に広げ、ProLong Glass Antifade Mountant でマウントしました。 画像は、100 倍の対物レンズを備えた Nikon Ti2 プラットフォーム上の横河 CSU-W1 スピニング ディスク システムを使用して取得されました。

推定上のネマトステラ遺伝子 v1g243188 および Nemve1_232014 を標的とする短いヘアピン RNA を T7 ポリメラーゼ反応によって合成し、Direct-zol RNA miniprep Plus キット (Zymo Research、カタログ番号: R2072) を使用して精製しました。 精製したshRNAを、以前に記載された方法に従って、1μg/μlの濃度で未受精卵にマイクロインジェクションするか、〜600ng/μl〜1μg/μlの濃度でエレクトロポレーションしました53,54。 卵子は野生型またはトランスジェニック雄の精子と受精した。 受精後、胚を 2 日間インキュベートし、TRITC で処理しました。 以下のプライマー (Integrated DNA Technologies) をアニーリングし、短いヘアピン RNA 合成の二本鎖テンプレートとして使用しました。

v1g243188 転送: TAATACGACTCACTATAGCGGTGGACTCTACTTATTTTCAAGAGAAATAAGTAGAGTCCACCGCTT および

v1g243188 逆: AAGCGGTGGACTCTACTTATTTCTCTTGAAAATAAGTAGAGTCCACCGCTATAGTGAGTCGTATTA

Nemve1_232014 転送:

TAATACACTCACTATAGCATCGTTACCAGTACAATTCAAGAGATTGTACTGGTAACGATGCCTT

Nemve1_232014 逆:

AAGGCATCGTTACCAGTACAATTCTCTTGAATTGTACTGGTAACGATGCCTATAGTGAGTCGTATTA

スクランブルフォワード:

TAATACGACTCACTATAGCAACACGCAGAGTCGTAATTCAAGAGATTACGACTCTGCTGTGTTGCTT

スクランブルリバース：

AAGCAACACGCAGAGTCGTAATCTCTTGAATTACGACTCTGCGTGTTGCTATAGTGAGTCGTATTA。

エレクトロポレーションを受けた動物を TRIzol 試薬 (Ambion、Ref: 15596018; Lot # 254707) に溶解し、メーカーの推奨に従って Direct-zol RNA Mini Prep Plus キット (Zymo Research、カタログ番号: R2072) を使用して RNA を抽出しました。 cDNA は、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems、カタログ番号:4382406、ロット番号 0124432) を使用して合成され、最後に、Luna Universal qPCR マスター ミックス (NEB、カタログ番号: M3003L) を使用して qRT-PCR が実行されました。 、ロット番号: 10133023)、次のプライマーを使用します (Integrated DNA Technologies):

GAPDH

前方 5'-GGACCAAGTGCCAAGAACTG-3'

逆 5'-GGAATGCCATACCCGTCAG-3'

v1g243188

前方 5'-CCGCCTTATCCTTCGTTGAT-3'

逆 5'-ATGCGGTGGACTCTACTTATTG

Nemve1_232014

前方 5'-TGTGAAGGAACGACGATGTG-3'

逆 5'-GACCGTTGATGACCTCGATAC-

定量的 RT-PCR データは前述のように分析されました 64。

すべての画像分析は Fiji (ImageJ、2.1.0/1.53c) で実行されました。 明るさ、コントラスト、ガンマは手動で調整されました。 背景は、フィジーの背景減算ツールを使用して減算されました。 補足の図6b、cでは、糸の構造をよりよく視覚化するために明るさが増加しました。 未排出および排出されたカプセルおよび細管の長さの測定は、Fiji (ImageJ) フリーハンド手動トレース ツールを使用して手動で実行され、結果は補足情報で説明されました。 物体の平均信号強度、面積、長さは、測定ツールを使用してフィジー (ImageJ) で取得されました。 結果は、補足情報に記載されている推定値に使用されました。 推定はWolfram Mathematica (12.0)で行われました。 図 4 では、モデルは Blender (2.93) で作成されました。

図３および図４のＥＭ顕微鏡写真については、 1d、e、および 2b ～ e、2 匹の異なる動物から連続切片を取得しました。 両方の動物の体積で観察された 350 個のカプセルから、未放出のカプセルの完全な体積 3 つと未放出のカプセルの部分体積 2 つの高解像度画像を取得しました。 フェーズ 1 では 1 完全体積の放出カプセル、フェーズ 2 では 2 完全体積の放出カプセル、フェーズ 3 では 3 つの部分体積と 1 完全体積の放出カプセルです。

標的遺伝子ノックダウンの qRT-PCR 検証のために、サンプルあたり約 200 個のポリープを使用して 3 つの独立したノックダウン実験を実行しました。 各サンプルを 3 回分析しました。 GraphPad Prism (9.3.1) を使用してグラフが生成され、統計分析が実行されました。 統計的有意性は、対応のない両側スチューデント t 検定を使用して決定されました。p 値は図の凡例に示されています。 コーエンの d を使用して、すべての t 検定分析の効果量 (グループ間の平均差をプールされた標準偏差で割ったもの) を評価しました。

部分的に排出された刺胞の代表的な蛍光画像は、ラブドフスキー試薬で固定された TRITC 処理動物の触手から取得され、10 回の独立した標識および排出実験で同一の結果が得られました。 図 1a は、6 匹の独立した産卵動物で観察された導入遺伝子発現の代表的な画像です。 図1bでは、線虫細胞とその莢膜は体柱の線虫細胞を表しています（n = 10の一次ポリープ体柱、5回の実験）。 図1cでは、カプセルは、約200個の一次ポリープから精製された小型（n = 19）および大型（n = 20）のバシトリチおよびp-マスチゴフォア（n = 10）の代表的な高倍率蛍光画像です。 図2aの画像シーケンスと補足ビデオ5〜7、10、11は、3つの独立した生きた放電実験から記録されました。

図2fおよび補足図2は、4つの独立した実験からの、部分的に排出された糸のシャフトと細管の代表的な超解像度画像でした。 図2gおよびhでは、部分的に放出された糸の代表的な画像から放出シーケンスが再構成されました（一次ポリープ触手からの部分的に放出された糸n = 67、3つの実験）。 図 3a は、部分的に放電した糸の代表的な SEM 画像です (n = 6)。 図 3b は、ラヴドフスキー試薬で固定された WGA および TRITC 染色された一次ポリープ触手の代表的な画像です (n = 10 一次ポリープ触手、3 回の実験)。 図 3c、d は、一次ポリープ触手に目に見える糸のうち、ステージ 1 の糸 (図 3c、n = 20) と二重壁のステージ 2 の糸 (図 3d、n = 8) の代表です。 図3e、fは、スクランブルコントロールshRNA（1/27触手からのn = 0/25スレッド）および5からのv1g243188 shRNA（1/25触手からのn = 25/25スレッド）の部分的に放電した一次ポリープ触手から取得された代表的な蛍光画像です。ノックダウン実験。 図 3g は、約 300 個の一次ポリープから精製され完全に排出された糸の代表的な画像です (n = 15 糸)。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

ソースデータはこのペーパーに付属しています。 この原稿の基礎となる元のデータは、Stowers Original Data Repository (ODR) (http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1684) からアクセスできます。

通信および資料のリクエストは [email protected] に送信してください。ソース データはこの文書に提供されます。

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この原稿に関して有益なコメントをくださった Alejandro Sánchez Alvarado、Jay Unruh、Kausik Si、Whitney Leach、Eric Hill、Subramanian Ramanathan に感謝します。 モデルのイラストに関しては Molly Simmons に感謝します。 実験にご協力いただいたXia Zhao氏とMorgan Harwood氏（電子顕微鏡コア）、および動物の維持管理についてはStowers爬虫類・水生生物施設に感謝いたします。 ミニコラーゲン Ncol4 抗体についてはハイデルベルク大学の Suat Ozbek 氏、トランスジェニック動物の作製については Ruohan Zhong 氏にご協力いただきましたことに感謝いたします。 この研究はストワーズ医学研究所から資金提供を受けました。

ストワーズ医学研究所、米国ミズーリ州カンザスシティ

アーメット・カラブルート、メラニア・マクレーン、ボリス・ルビンスタイン、キース・Z・セイビン、ショーン・A・マッキニー、マシュー・C・ギブソン

米国カンザス州カンザスシティ、カンザス大学医学部解剖学および細胞生物学部

マシュー・C・ギブソン

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AK と MCG はこの研究を構想しました。 AK、BR、MCG が原稿を書きました。 AK、SMC、MMKZS、BR が実験を実施し、データを分析しました。

アーメット・カラブルートまたはマシュー・C・ギブソンへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Nicholas Money と他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Karabulut, A.、McClain, M.、Rubinstein, B. 他。 刺胞動物の刺す細胞小器官の構造と作動機構。 Nat Commun 13、3494 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-31090-0

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受信日: 2021 年 9 月 29 日

受理日: 2022 年 6 月 2 日

公開日: 2022 年 6 月 17 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-31090-0

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